Skp2和p27kip1在浆液性卵巢肿瘤组织中的表达与临床意义-中华临床医师杂志（电子版）

　　p²⁷基因是近年来发现的一种抑癌基因，目前认为其编码的产物p27^kip1蛋白为一种细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂，可以通过多种方式参与细胞周期调控，阻止细胞从G₁期到S期的转变，最终抑制细胞分裂、增殖，促进细胞分化、凋亡。Skp2作为泛素蛋白酶体途径的底物识别序列，因能泛素化降解p27^kip1而与肿瘤关系密切。二者的异常表达与肿瘤组织发生发展以及生物学行为有着密切的关系，是判断肿瘤恶性程度、转移与预后的重要参考指标。

　　一、对象和方法

　　1. 研究对象：选取青岛大学医学院附属烟台毓璜顶医院2000年1月至2004年12月卵巢浆液性上皮性肿瘤124例为研究对象。其中良性腺瘤24例，交界性肿瘤20例，卵巢浆液性腺癌80例。全部病例手术前未接受任何治疗(手术初治者)，患者年龄26～78岁，均有完整临床病理资料。FIGO分期(1988)：Ⅰ、Ⅱ期52例，Ⅲ、Ⅳ期28例；组织学分级：高分化24例，中低分化56例；淋巴转移20例。标本离体后经10%中性福尔马林固定48 h，石蜡包埋，切片厚度4 μm，常规HE染色和SP免疫组化染色。

　　2. 实验方法：采用免疫组化链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶染色法(SP法)检测124例卵巢浆液性上皮性肿瘤组织中Skp2、p27^kip1的表达。

　　3. 主要试剂：Skp2鼠抗人浓缩单克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology公司，克隆号2C8D9 Cat No.SC-7164)，稀释1∶50为工作液；p27鼠抗人单克隆抗体(福州迈新生物技术开发有限公司，克隆号DCS-72.F6 Cat No.LA1147)；SP试剂盒：试剂A Post-blocking，试剂B Poly-HRP-Anti Mouse IgG(福州迈新生物技术开发有限公司)；DAB显色试剂盒(福州迈新生物技术开发有限公司，克隆号Cat No.DAB-0031/1031)。

　　4. 结果的判断：DAB显色后，Skp2阳性细胞的胞核为棕黄色或棕褐色，胞浆也可有少量的棕黄色或棕褐色颗粒。Skp2主要表达在卵巢肿瘤上皮细胞的细胞核，胞浆也可有少量着色。p27^kip1染色以胞核(或胞浆)出现棕黄色颗粒为其阳性判定标准。所有阳性细胞综合染色强度和阳性细胞所占百分比进行平均半定量处理。染色强度评分标准：不着色0分，黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分；阳性细胞比例评定标准^[1]：每张标本随机选取5个高倍镜(×400)视野，计算平均阳性细胞所占百分率。阳性细胞数＜5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，＞50%为3分。两种评分得分相加，0～1分为(－)，2～3分为(＋)，4～6分为(＋＋)。

　　5. 统计学处理：实验数据采用SPSS 11.5统计软件进行Kruskal-wallis检验、Mann-Whitney检验；Skp2、p27^kip1之间的相关性用Spearman′s分析。P<0.05为差异有统计学意义，P<0.01为差异有显著统计学意义。

　　二、结果

　　1. Skp2和p27^kip1蛋白在卵巢浆液性上皮性肿瘤中的表达情况(表1，2)：Skp2蛋白在卵巢癌细胞的细胞核部位染色阳性，低分化的癌细胞常出现Skp2蛋白染色强阳性，而在良性浆液性腺瘤、交界性浆液性腺瘤组织中偶见Skp2细胞核表达(图1)。在卵巢癌中Skp2蛋白表达阳性率(47.5%)显著高于良性(4%)、交界性卵巢肿瘤(5%)(P<0.01)。而p27^kip1蛋白表达阳性率在良性卵巢肿瘤(83.3%)、交界性肿瘤(70.0%)(图2)中显著高于卵巢癌组织(35.0%)(图3)(P<0.01)。低分化卵巢腺癌中Skp2表达(60.7%)(图4)明显高于高分化腺癌(16.6%)(图5)。低分化卵巢腺癌中p27^kip1表达(25%)(图6)明显高于高分化腺癌(58.3%)(图3)。

表1　卵巢浆液性上皮性肿瘤组织中Skp2蛋白表达比较(例)

组别	例数	Skp2表达			阳性率(%)
组别	例数	－	＋	＋＋	阳性率(%)
恶性组	80	42	12	26	47.5
交界性组	20	19	1	0	5.0
良性组	24	23	1	0	4.0

　　注：恶性组与交界性组比较Z＝－3.505，P＜0.01；恶性组与良性组比较Z＝－3.852，P＜0.01；交界性组与良性组比较Z＝－0.131，P＞0.05

表2　卵巢浆液性上皮性肿瘤组织中p27^kip1蛋白表达比较(例)

组别	例数	p27^kip1表达			阳性率(%)
组别	例数	－	＋	＋＋	阳性率(%)
恶性组	80	52	24	4	35.0
交界性组	20	6	4	10	70.0
良性组	24	4	4	16	83.3

　　注：恶性组与交界性组比较Z＝－3.824，P＜0.01；恶性组与良性组比较Z＝－5.530，P＜0.01；交界性组与良性组比较Z＝－1.177，P＞0.05

　　2.Skp2和p27^kip1蛋白表达与卵巢浆液性腺癌各项临床病理特征的关系(表3，4)：Skp2蛋白表达与肿瘤组织分化程度、临床分期及有无淋巴转移密切相关(P＜0.01)。Skp2蛋白的表达与患者的年龄无关(P>0.05)；而p27^kip1蛋白表达则与肿瘤组织分化程度、临床分期及有无淋巴转移等临床病理特征负相关(P<0.05)。

表3　Skp2蛋白与卵巢浆液性腺癌各项临床病理特征的关系

临床病理特征	例数	Skp2表达			χ²值	P值
临床病理特征	例数	－	＋	＋＋	χ²值	P值
年龄
＜50岁	30	16	2	12	3.021	＞0.05
≥50岁	50	26	10	14
病理分级
Ⅰ期	24	20	4	0	17.197	＜0.01
Ⅱ～Ⅲ期	56	22	8	26
手术病理分期
Ⅰ～Ⅱ期	52	32	10	10	11.982	＜0.01
Ⅲ～Ⅳ期	28	10	2	16
淋巴结转移
有	20	4	1	15	21.689	＜0.01
无	60	38	11	11

表4　p27^kip1蛋白与卵巢浆液性腺癌各项临床病理特征的关系(例)

临床病理特征	例数	p27^kip1表达			χ²值	P值
临床病理特征	例数	－	＋	＋＋	χ²值	P值
年龄
＜50岁	30	20	6	4	8.184	＞0.01
≥50岁	50	32	18	0
病理分级
Ⅰ期	24	10	12	2	8.103	＜0.01
Ⅱ～Ⅲ期	56	42	12	2
手术病理分期
Ⅰ～Ⅱ期	52	28	22	2	10.607	＜0.01
Ⅲ～Ⅳ期	28	24	2	2
淋巴结转移
有	20	18	0	2	11.749	＜0.01
无	60	34	24	2

　　3. Skp2与p27^kip1在卵巢浆液性上皮性肿瘤中表达的关系(表5)：在良性与交界性肿瘤p27^kip1阴性和阳性表达组中，几乎无Skp2阳性表达，p27^kip1

表5　卵巢浆液性肿瘤组织中Skp2与p27^kip1蛋白表达的关系(例)

p27^kip1	例数	Skp2表达
p27^kip1	例数	－	＋	＋＋
良性与交界性肿瘤
－	10	10	0	0
＋	8	6	2	0
＋＋	26	26	0	0
恶性肿瘤
－	52	19	8	25
＋	24	19	4	1
＋＋	4	4	0	0

　　与Skp2在卵巢浆液性囊腺瘤和交界性囊腺瘤中的表达无关(P>0.05)。在浆液性腺癌中p27^kip1(－)组，Skp2阳性率为61.5%(32/52)；p27^kip1(＋)组中，Skp2阳性率为20.0%(5/24)；p27^kip1(＋＋)组中，Skp2无阳性表达。根据Spearman′s相关分析表明，在卵巢浆液性上皮性癌中Skp2与p27^kip1的表达呈负相关(r＝－0.515，P＜0.01)。

　　三、讨论

　　细胞周期是细胞生命活动的基本过程，细胞周期主要由正负调控蛋白调控。p27^kip1作为细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(cyclin-dependent kinase inhibitor，CKI)家族的一员，具有阻止细胞通过G₁至S期转换的“关卡”作用，从而抑制细胞的增殖。Traub等^[2]等采用免疫组化法检验338例乳腺癌患者组织中Skp2和p27^kip1蛋白的表达，结果表明，将Skp2和p27^kip1结合可预示乳腺癌恶性程度，高Skp2低p27^kip1预示不良过程。Patah等^[3]对65例卵巢肿瘤患者和18例正常的卵巢组织中的p27^kip1蛋白表达进行研究发现，卵巢癌组织中的p27^kip1表达阳性率明显低于良性卵巢肿瘤和正常卵巢组织中的p27^kip1。本试验研究显示，在良性、交界性和恶性肿瘤组织中p27^kip1蛋白表达逐渐降低。本研究还分析了p27^kip1蛋白表达与临床病理参数的关系，结果表明，p27^kip1蛋白在不同年龄的卵巢癌中表达差异无统计学意义，而其表达水平在中低度分化组、Ⅲ～Ⅳ期组和有淋巴结转移组分别明显低于高分化组、Ⅰ～Ⅱ期组和无淋巴结转移组，与国外研究一致^[3]。这提示p27^kip1的表达下降可能会促进上皮性卵巢癌的恶性生物学行为。

　　在研究蛋白质降解途径的过程中，发现了一大类E3酶(泛素-连接酶)，称作SCF复合体，它们能使底物蛋白通过磷酸化的方式被蛋白酶体(proteasome)降解。SCF由Skp1、一种Cullin(Cdc53)、Rbx1/Roc1/Hrt1和F-box蛋白家族中的某个成员组成。其中，F-box蛋白家族的一个共同特征是含有F-box基序(motif)，这种基序由大约50个氨基酸组成，是介导与其他蛋白质发生相互作用的位点。由于这种基序首先在CyclinF中发现，故将其命名为F-box。Skp2是E3酶系中SCFSkp2的底物识别亚单位，Skp2作为泛素蛋白酶体途径的底物识别序列，既能泛素化降解一种主要的CKI p27^kip1，又能介导另外两种CKI：p57^kip2、p21^Cip1的泛素化和水解，与恶性肿瘤的发生有关。有研究表明Skp2具有癌基因功能，在乳腺癌、结肠癌、胃癌等多种恶性肿瘤中表达增加，同时伴随p27^kip1蛋白水平降低，Skp2表达增加同样提示肿瘤恶性程度高和预后不佳^[4]。Shigemasa等^[5]发现Skp2在良性卵巢腺瘤和潜在恶性病变中几乎缺如，而在47.3%的卵巢腺癌中有表达，半定量PCR发现Skp2 mRNA在所有卵巢腺癌中大幅增高。Log-rank检验显示Skp2过度表达与患者预后不良有关。他们的研究表明，在卵巢腺癌的发生、发展过程中，Skp2起重要作用，并且Skp2的高表达是卵巢癌的一个独立的预后标志。Sui等^[6]在研究卵巢上皮性肿瘤结果中表明，Skp2和p27^kip1在良性与恶性卵巢瘤中表达呈负相关。为进一步探讨Skp2蛋白在卵巢癌的发展进程中的作用，我们分析了Skp2蛋白表达与临床病理参数的关系，结果表明，Skp2蛋白在不同年龄卵巢癌中表达差异无统计学意义。而Skp2蛋白表达在中低分化组、Ⅲ～Ⅳ期组及有淋巴结转移组分别明显高于高分化组、Ⅰ～Ⅱ期组及无淋巴结转移组，这些临床病理参数是与患者预后密切相关的重要因素，因此这些结果表明，Skp2蛋白的表达上调可能与卵巢癌的恶性进展有关。本研究还对Skp2和p27^kip1的关系进行了研究，证明二者呈负相关。

　　总之，p27^kip1的表达下降和Skp2的表达升高在上皮性卵巢肿瘤的发生发展中可能起一定作用，综合分析p27^kip1、Skp2蛋白表达可能对临床上浆液性卵巢癌的预后估计有一定指导意义。同时，p27^kip1、Skp2途径的研究将为卵巢上皮性肿瘤的预防和治疗提供新的思路。

　　(本文图1～6见PDF)

Skp2和p27kip1在浆液性卵巢肿瘤组织中的表达与临床意义

参考文献