临床研究

2型糖尿病患者FAT/CD36基因启动子区-3489C/T和密码子区478C/T多态性研究

曾蓉，严新民，宋滇平，高建梅
作者单位:曾蓉、宋滇平，昆明医学院第一附属医院糖尿病科，650031；严新民、高建梅，云南省第一人民医院基础医学研究所
通讯作者:宋滇平，Email：drsongdp@sina.com
摘要：目的　探讨FAT/CD36脂肪酸转位酶基因启动子区-3489C/T和密码子区478C/T多态性与2型糖尿病(T2DM)的相关性。方法　运用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性技术对196例T2DM患者和120例正常对照者的-3489C/T与478C/T多态性进行检测，并比较各组间基因型频率和等位基因频率以及相关临床资料。结果　(1)所有研究对象均无一例存在FAT/CD36基因启动子区478C→T突变，基因型均表现为478CC之纯合子，478CC和478TT等位基因频率分别为1和0。(2)T2DM组和正常对照组的-3489C/T多态性基因型和等位基因频率比较差异无统计学意义，P值分别为0.682和0.683。结论　昆明地区的汉族人中FAT/CD36基因的启动子区-3489C/T和密码子区478位C/T多态性与昆明地区汉族人群2型糖尿病的发生无显著相关关系。
关键字：糖尿病，2型；态现象，遗传；脂肪酸转位酶
Correlation between fatty acid translocase gene polymorphism and Chinese type 2 diabetes mellitus　ZENG Rong，YAN Xin-min，SONG Dian-ping*，GAO Jian-mei.*Diabetic Department，The First Affiliated Hospital of Kunming Medical College，Kunming 650031，China
Corresponding author：SONG Dian-ping，Email：drsongdp@sina.com
　　【Abstract】　Objective　To study the correlation between fatty acid translocase(FAT/CD36) gene promoter region -3489C/T and code region 478C/T polymorphism and type 2 diabetes mellitus.Methods　-3489C/T and 478C/T polymorphism were screened in 196  type 2 diabetic patients and 119 normal controls by polymerase chain reaction restriction fragment lenth polymorphism method (PCR-RFLP).Results　(1)All subjects proved to be homozygote wildtypes (CC) for the 478C→T substitution.(2)No significant differences were found  in alleles and genotype frequencies of FAT/CD36 gene-3489C/T polymorphism between diabetic patients and non-diabetic contronls.Conclusions　FAT/CD36 gene-3489C/T or 478C/T polymprphism was not significantly associated with  type 2 diabetes mellitus in Han people of Yunnan.
　　【Key words】　Diabetes mellitus，Type 2；　Polymorphism，Genetic；　Fatty acid translocase
 
　　FAT/CD36(fatty acid translocase，脂肪酸转位酶)是一种跨膜糖蛋白，可与多种配基相结合，它在体内分布广泛，在骨骼肌纤维膜和线粒体膜也有分布，是调节脂肪酸代谢的重要因子，在高脂血症、动脉粥样硬化、肥胖及2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)等疾病的发病机制中可能发挥重要作用。
　　现在关于FAT/CD36基因多态性与T2DM的研究报道很少。最近有国外文献报道FAT/CD36基因上游启动子区-3489位点C→T突变与高加索人T2DM直接相关，并认为是其危险因素[1]。之前有日本学者报道FAT/CD36基因478位C→T突变在患有心脏疾病日本人中与FAT/CD36基因表达受损有关，而FAT/CD36基因表达受损又与日本人的胰岛素抵抗相关[2]。本研究选择云南地区汉族人为研究对象，探讨T2DM患者FAT/CD36基因多态性基因型和等位基因频率分布特征，揭示FAT/CD36基因遗传变异与T2DM发病的关系。
 
对象和方法
　　一、研究对象
　　T2DM组(T2DM组)：样本来自云南省第一人民医院相关科室，共196例，患者彼此间无血缘关系。T2DM按1999年WHO标准确诊，且发生糖尿病之前均无高血压病史，无心血管疾病家族史。正常对照组(Control组)：样本来自云南省第一人民医院，共120例，相互之间无血缘关系。经体格检查，排除糖尿病、高血压、冠心病及肾病，且均无糖尿病家族史。
　　二、标本收集及处理
　　受试者禁食12 h，于清晨7时取肘静脉血2 ml，置于EDTA抗凝管中，4 ℃保存，24 h内应用百泰康公司的细胞/组织基因组DNA试剂盒提取血液基因组DNA，于4 ℃保存备用。
　　三、FAT/CD36基因478C/T多态性分析
　　所用引物参考文献[1]：以5′-CTgACTCAA ggCTgCAAACA-3′为上游引物，5′-TTAggATTC TATACAgACAggAAAA-3′为下游引物(TaKaRa)。PCR扩增体系为25 μl：模板3.5 μl，水14.95 μl，引物(200 μmol/L)各0.3 μl(终浓度为0.24 pmol/L)，TaKaRa Taq酶(5 u/μl) 0.2 μl，10×PCR缓冲液(含Mg2＋)2.5μl，dNTP混合物(各2.5 μmol/L)2.0 μl，于2720型PCR扩增仪(美国Applied Biosystems公司)上扩增。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性45 s，51.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共30个循环，最终72 ℃ 5 min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳证实后(图1)，取PCR扩增产物为400 bp的碱基片段7 μl，加入EC001091限制性内切酶(TaKaRa)6 u，10×buffer 1.5 μl，37 ℃水浴消化16 h，终止反应。取15 μl扩增产物与含有荧光染料6×上样缓冲液(含溴酚蓝和二甲苯青)1 μl充分混合，在2%琼脂糖凝胶上做电泳，以DL2000 DNA Marker为标准分子量对照，取15 μl酶切产物与2 μl含有荧光染料6×上样缓冲液混合而成，以0.5×TBE为电泳缓冲液，100 V电压电泳，至溴酚蓝指示剂移动合适的位置后停止电泳，于凝胶成像仪下观察图像。
　　四、FAT/CD36基因-3489C/T多态性分析
　　所用引物自行设计：以5′-CACTACTCCCT ggTTTCTTC-3′为上游引物，5′-CTgCCTgACACT CTTTATCC-3′为下游引物(TaKaRa)。PCR扩增体系为25 μl：模板3.0 μl，水15.45 μl，引物(200 μmol/L)各0.3 μl(终浓度为0.24 pmol/L)，TaKaRa Taq酶(5 u/μl)0.2 μl，10×PCR缓冲液(含Mg2＋)2.5 μl，dNTP混合物(各2.5 μmol/L) 2.0 μl，于2720型PCR扩增仪(美国Applied Biosystems公司)上扩增。PCR反应条件：同478 C/T。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳证实后(图1)，取PCR扩增产物为493 bp的碱基片段7 μl，加入ALwNI限制性内切酶(基因公司)5 u，10×buffer 1.5 μl，37 ℃水浴消化16 h，65 ℃水浴20 min，终止反应。取15 μl扩增产物与含有荧光染料6×上样缓冲液(含溴酚蓝和二甲苯青)1 μl充分混合，在2%琼脂糖凝胶上做电泳，以DL2000 DNA Marker为标准分子量对照，取15 μl酶切产物与2 μl含有荧光染料6×上样缓冲液混合而成，以0.5×TBE为电泳缓冲液，100 V电压电泳，至溴酚蓝指示剂移动合适的位置后停止电泳，于凝胶成像仪下观察图像。
　　五、测序
　　为证实FAT/CD36基因确实存在以上两个多态性位点，用ABI3130测序仪对样本进行测序。
　　六、统计学处理
　　各组临床参数用均数±标准差 描述，组间均数比较用t检验或q检验；计算各组基因型频率及等位基因频率，组间频率比较用χ2检验，以Hardy-Winberg平衡法检验各组基因频率群体代表性，P<0.05为差异有统计学意义；用SPSS 13.0 for Windows软件处理数据。
 
结　　果
　　一、FAT/CD36基因478的酶切结果
　　FAT/CD36基因密码子区由478C→478T(GTCCT→GTTCT)后在扩增产物的第228 bp处产生了一个酶切位点，因此CC基因型有228 bp和172 bp两条片段，CT型有400 bp、228 bp和172 bp三条片段，TT基因型有400 bp一个片段。本组研究对象中无论是T2DM组还是Control组均未发现突变的TT基因型和杂合子CT基因型(图2)，基因型均表现为478CC之纯合子。
　　二、FAT/CD36基因-3489的酶切结果
　　FAT/CD36基因启动子区由-3489T→-3489C(CATAG→CACAG)后在扩增产物的第152 bp处产生了一个酶切位点，因此CC基因型有152 bp和341 bp两条片段，CT型有493 bp、152 bp和341 bp三条片段，TT基因型只有493 bp一条片段(图3)。
　　三、统计结果
　　在两组FAT/CD36(C478T)基因位点、FAT/CD36(T-3489C)基因位点的基因型分布均符合Hardy-Winberg定律(P>0.05)。所有研究对象478C/T基因型均表现为478CC之纯合子，478CC和478TT等位基因频率分别为1和0(表1)；T2DM组-3489CC基因型和等位基因频率与对照组比较差异无统计学意义(表2)。
 
表1两组患者478C/T多态性基因型频率和等位基因频率比较　
组别
例数
基因型
 
等位基因
CC
 
C/T
 
TT
 
C
 
T
 
例
%
 
例
%
 
例
%
 
例
%
 
例
%
 
T2DM组
196
196
100
 
0
0
 
0
0
 
402
100
 
0
0
 
Control组
119
119
100
 
0
0
 
0
0
 
238
100
 
0
0
 
 
表2　两组患者FAT/CD36-3489C/T多态性基因型频率和等位基因频率比较
组别
例数
基因型
 
等位基因
TT
 
C/T
 
CC
 
C
 
T
 
例
%
 
例
%
 
例
%
 
例
%
 
例
%
 
T2DM组
196
74
37.8
 
 96
49.0
 
26
13.3
 
148
37.8
 
244
62.2
 
Control组
119
45
37.8
 
62
52.1
 
12
10.1
 
  86
36.1
 
152
63.9
 
χ2值
   
 
 
 
0.765
 
 
 
 
 
0.167
 
 
P值
 
 
 
 
0.682
 
 
 
 
 
0.683
 
 
 
　　四、测序结果
　　测序证实FAT/CD36基因478位点只有CC基因型(图4)，-3489位点有CC、CT和TT基因型(图5～7)，与用限制性酶切方法所做结果一致。
 
讨　　论
　　T2DM的确切病因和确切发病机制迄今尚未完全明了，目前普遍认为它是一种多基因遗传背景的多因子疾病。国内外大量研究发现有多种基因和基因位点的变异与T2DM相关，但不同地区和不同人种间却存在着明显差异，这就表明T2DM不仅具有强烈的遗传倾向，而且有着明显的遗传异质性。
　　FAT/CD36是单链跨膜细胞表面蛋白。人FAT/CD36的基因高度保守，定位于第七号染色体的q11.2，有15个外显子，长32 kb。人FAT/CD36含471个氨基酸残基，由于糖基化度不同，在不同的细胞中具有不同的分子量，约为78～88 kb[3]。FAT/CD36广泛存在于脂肪酸代谢活跃的组织，如心肌、骨骼肌、小肠和脂肪组织。研究表明，人骨骼肌的肌纤维膜、线粒体膜和细胞内储存池(内含体)上均富含FAT/CD36[4]。FAT/CD36的蛋白表达水平与脂肪酸吸收障碍和胰岛素抵抗相关。据报道，骨骼肌细胞脂肪酸转运障碍导致细胞内甘油三酯的聚积，增加了胰岛素抵抗和T2DM的危险性。现已证实，当骨骼肌收缩，被电刺激或有胰岛素作用时，FAT/CD36从细胞内易位到肌纤维膜，转运游离脂肪酸至细胞内，参与脂肪酸的氧化。一旦FAT/CD36基因表达障碍或突变就会造成脂肪酸的堆积，增加了胰岛素抵抗的危险性[5]。T2DM伴有明显的胰岛素抵抗，脂肪酸代谢障碍是胰岛素抵抗的特点，有研究表明，用噻唑烷二酮(TZD)类胰岛素增敏药可以通过上调骨骼肌FAT/CD36的表达来增加长链脂肪酸的摄取[6]。2006年Corpeleijn等[1]首次报道，FAT/CD36基因-3489位点TT基因型与高加索人，尤其是女性和肥胖者T2DM直接相关，并认为是其危险因素，同时所有被研究对象的478位点均是CC纯合子，在这次研究的高加索人群中未发现T等位基因，相关的研究在其他人群中未见报道。
　　本研究以昆明地区T2DM患者和健康汉族人为研究对象，以期揭示FAT/CD36基因启动子区478-C/T遗传变异与T2DM发病的关系，结果发现所有研究对象478C/T基因型均表现为478CC之纯合子，未发现突变的TT基因型，C和T等位基因频率在T2DM组和Control组间差异无显著统计学意义，与Corpeleijn等[7]的研究结果相同。本次研究还发现FAT/CD36基因-3489C/T多态性在T2DM患者和正常人群的分布无统计学意义，与国外学者的报道不一致。这可能是由于遗传背景不同，本研究人群FAT/CD36基因-3489C/T多态性与其他种族或地区人群存在差异，提示该基因变异存在种族异质性。因此需进一步加大样本或发现影响该基因及其多态性的未知因素，来证实FAT/CD36基因遗传变异特征。综上所述，在中国云南昆明地区的汉族人中，FAT/CD36基因的启动子区-3489C/T和密码子区478位C/T多态性与昆明地区汉族人群T2DM的发生无显著相关关系。
　　（本文图1～7见PDF）

参考文献

[1]　Corpeleijn E， van der Kallen CJ， Kruijshoop M， et al. Direct association of a promoter polymorphism in the CD36/FAT fatty acid transporter gene with Type 2 diabetes mellitus and insulin resistance.Diabet Med，2006，23(8)：907－911.[PubMed]
[2]　Tanaka T， Nakata T， Oka T， et al.Defect in human myocardial long-chain fatty acid uptake is caused by FAT/CD36 mutations.J Lipid Res，2001，42(5)：751－759.[PubMed]
[3]　高磊，鲍羿，洪斌.B类清道夫受体CD36的研究进展.医学分子生物学杂志，2006，3(1)：61－64.
[4]　Bezaire V， Bruce CR， Heigenhauser GJ， et al.Identification of fatty acid translocase on human skeletal muscle mitochondrial membranes：essential role in fatty acid oxidation.Am J Physiol Endocrinol Metab，2006，290(3)：E509－515.[PubMed]
[5]　Luiken JJ， Dyck DJ， Han XX， et al. Insulin induces the translocation of the fatty acid transporter FAT/CD36 to the plasma membrane.Am J Physiol Endocrinol Metab，2002，282(2)：E491－495.[PubMed]
[6]　Wilmsen HM， Ciaraldi TP， Carter L， et al.Thiazolidinediones upregulate impaired fatty acid uptake in skeletal muscle of type 2 diabetic subjects.Am J Physiol Endocrinol Metab，2003，285(2)：E354－362.[PubMed]
[7]　Corpeleijn E，Saris WH，Jansen EH，et al.Postprandial interleukin 6 release from skeletal muscle in men with impaired glucose tolerance can be reduced by weight loss.J Clin Endocrinol Metab，2005，90(10)：5819－5824.[PubMed]