脑梗死是由多种因素综合作用所致，近年的研究发现，脑梗死与遗传因素有关，提示其发病机制可能是环境因素和遗传因素共同作用的结果[1]。目前，对载脂蛋白E（apoE）基因多态性与脑梗死关系的研究日趋增多，但研究结果差异较大。为此我们采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）技术，结合DNA银染技术检测apoE基因多态性，研究保定市中老年人群中apoE基因型的频率及分布，探讨保定市中老年人群apoE基因多态性与脑梗死发病风险的关系。
一、资料与方法
1. 临床资料：所有资料均选自2007年3月至2009年2月在保定市第三医院健康体检者及脑梗死就诊者178例，均为无血缘关系并且在保定市生活30年以上的汉族人。（1）健康人群组：从健康体检者中随机抽取86例作为健康人群组，男52例，女34例，平均年龄（57±10）岁；入选标准：既往身体健康，排除有阿尔茨海默病、脑血管病、心肝肾疾病、糖尿病、血液病、自身免疫性疾病、甲状腺疾病。（2）脑梗死组：在保定市第三医院就诊的经临床诊断为脑梗死住院患者92例，男56例，女36例，平均年龄（58±10）岁；入选标准：符合1995年全国第四届脑血管病学术会议的诊断标准[2]，并经头颅CT或MRI确诊；排除心源性、动脉炎、脂肪栓子、药物、肿瘤等引起的脑梗死。以上两组年龄、性别差异无统计学意义（P＞0.05）。
2. 采血：全部为抽取晨起空腹12～14 h抗凝静脉血3 ml。采用NaCl盐析法提取基因组DNA，－20 ℃保存。
3. 试剂配置及来源：抗凝剂，DNA提取试剂，红细胞裂解液（军事医学科学院研究室提供），TE缓冲液，储存液SDS，蛋白酶K（Sigma公司提供），PCR试剂：4种dNTPs（Sigma公司提供），引物：上游引物序列5′-AACAACTGACCCCGGTGGCG-3′和下游引物序列5′-ATGGCGCTGAGGCCGCGCTC-3′，反应引物按文献[3]设计，由中山医科大学基因中心合成。10%二甲基亚砜，Taq DNA聚合酶（Sigma公司提供），10倍PCR缓冲液。电泳试剂：2%琼脂糖凝胶、限制性内切酶HhaⅠ（Sigma公司提供）、限制性内切酶缓冲液。
4. apoE基因的PCR扩增：扩增apoE基因第四外显子中含多态性位点的DNA片段，扩增产物长度299 bp。PCR反应体系50 μl，包括0.5 μg基因组DNA，4种dNTPs终浓度200 μmol/L，引物终浓度0.2 μmol/L，10%二甲基亚砜，Taq DNA聚合酶2.5 U，10倍PCR缓冲液5 μl。反应体系用50 μl石蜡油覆盖，94 ℃预变性4 min，然后按94 ℃变性1 min→65 ℃退火1 min→72 ℃延伸1 min进行35个循环，最后72 ℃再延伸7 min。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳，电泳时间1 h。溴化乙啶染色，在UV灯下发橘红色荧光，检测扩增结果呈现299 bp的扩增产物。
5. apoE基因RFLP分析：取扩增产物5 μl，加入6 U HhaⅠ内切酶及其缓冲液，加双蒸水（ddH2O）使总体积达20 μl，37 ℃消化4～5 h。酶切产物经5%聚丙烯酰胺凝胶电泳，溴乙啶室温染色40 min，水洗，UV灯下观察DNA带型并照相。按照Hixson等[4]的方法进行apoE基因分型，根据3种等位基因特异性片段的不同，可在电泳图谱上鉴定apoE基因不同的基因型。
6. 基因型和等位基因频率计算方法：基因型频率＝基因型频数/总例数；等位基因频率＝（纯合子基因型频率＋杂合子基因型频率）/2。
7. 统计学处理：应用SPSS 10.0统计软件进行分析，两组间计数资料的比较采用χ2检验，检验标准α＝0.05。
二、结果
1. apoE的PCR扩增产物（图1）：apoE经PCR扩增后为299 bp的特异性条带。
2. 健康人群组apoE基因型（图2）：PCR-RFLP检测结果显示，健康人群组的apoE基因呈多态性，有6种基因型，即3种纯合子（ε2/2、ε3/3、ε4/4）和3种杂合子（ε2/3、ε3/4、ε2/4）全部检出，通过与分子量标准物Marker比较读出基因型如下：ε2/2基因型有91 bp、83 bp、61 bp 3个条带，ε3/3基因型有91 bp、61 bp、48 bp、35 bp 4个条带，ε4/4基因型有72 bp、61 bp、48 bp、35 bp 4个条带，ε2/3基因型有91 bp、83 bp、61 bp、48 bp、35 bp 5个条带，ε3/4基因型有91 bp、72 bp、61 bp、48 bp、35 bp 5个条带，ε2/4基因型有91 bp、83 bp、72 bp、61 bp、48 bp、35 bp 6个条带。
3. 两组apoE基因型频率和等位基因频率（表1）：结果显示两组apoE基因型分布以ε3/3多见，分别在健康组为75.5%，脑梗死组为42.3%，经χ2检验，ε3/3、ε3/4和ε4/4基因型频率在健康组与脑梗死组之间差异均有统计学意义（P＜0.05），ε2/2、ε2/3和ε2/4基因型频率在两组间分布差异均无统计学意义（P＞0.05）；ε3、ε4等位基因频率在两组间分布差异均有统计学意义（P＜0.05），ε2等位基因频率在两组间分布差异无统计学意义（P＞0.05）。
表1 脑梗死组与健康人群组apoE等位基因及基因型频率的比较[%，（频数）]
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组别
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ε2
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ε3
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ε4
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ε2/2
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ε3/3
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ε4/4
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ε2/3
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ε2/4
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ε3/4
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健康人群组
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5.8（5）
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87.2（75）
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7.0（6）
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0（0）
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75.5（65）
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1.2（1）
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10.5（9）
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2.3（2）
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10.5（9）
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脑梗死组
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4.3（4）
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69.6（64）
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26.1（24）
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3（3）
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42.3（39）
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10.8（10）
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11.9（11）
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2（2）
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30（27）
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Χ2值
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0.199
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8.08
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11.58
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2.85
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20.158
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5.297
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0.099
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0.196
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10.765
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P值
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＞0.05
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＜0.05
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＜0.05
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＞0.05
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＜0.05
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＜0.05
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＞0.05
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＞0.05
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＜0.05
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三、讨论
本研究结果显示，保定市中老年人群apoE基因呈多态性，存在6种不同apoE表型：ε2/2、ε3/3、ε4/4、ε2/3、ε2/4、ε3/4。保定市健康人群组apoE ε3基因出现率最高，ε2和ε4频率较低，以ε3/3基因型最多，而ε2/2、ε4/4、ε2/4相对较少，结果与我国对汉族人apoE等位基因频率研究结果基本一致[5-6]，ε3被认为是“野生基因”，ε2和ε4是由其变异得来。我们的研究结果显示：脑梗死患者中ε2等位基因频率最低，ε4等位基因频率增高，显著高于健康人群组（χ2＝11.58，P＜0.05）；ε3等位基因频率较健康人群组明显降低（χ2＝8.08，P＜0.05），ε4等位基因频率与脑梗死发病危险性有关，提示ε4等位基因是脑梗死的遗传易感因子，与Chowdhury等[7]及夏昱等[8]研究结果相一致。ε3等位基因是保护性基因，与沈丽华等[9]报道相一致。
王景华等[1]研究结果认为，apoE ε4为脑梗死发病的遗传易感因子。脑梗死组apoE ε4等位基因频率明显高于正常对照组（P＜0.05），脑梗死组apoE ε2等位基因频率低于正常对照组。apoE ε4导致脑梗死的机制至今未明，可能与血脂代谢紊乱有关。研究发现，apoE对血脂水平有一定的影响，在健康人群中，apoE ε2有降低总胆固醇、甘油三酯（TG）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）的作用，而apoE ε4有升高血浆总胆固醇、LDL-C和TG水平的作用；在脑梗死患者中，apoE ε2有升高高密度脂蛋白（HDL）的作用，apoE ε4有升高TG的作用[10]。
脑梗死危险因素包括年龄、吸烟、高血压病、糖尿病、血脂水平和遗传因素等，基因突变与脑梗死的相关性研究是近年来的研究热点，在遗传因素的探索中遗传对血脂代谢的影响令人关注。apoE具有明显的基因多态性，apoE的不同基因型不仅与血脂异常和动脉粥样硬化相关，而且与心脑血管疾病的发生与发展相关。研究已证实，apoE基因多态性与动脉粥样硬化和冠心病发生的危险性密切相关[11]，而其与脑梗死的关系研究结果尚不一致。国内外对apoE基因多态性与脑梗死相关关系的临床研究较多。有研究发现ε4等位基因与脑梗死密切相关[9，12-14]，ε4等位基因是脑梗死的遗传标记物。也有研究认为，ε4等位基因频率的高低与脑梗死无明显关系[10，15]。
本研究以保定市汉族人群为背景，发现ε3/3、ε4/4、ε3/4基因型在健康人群组和脑梗死组之间差异有统计学意义，同时发现等位基因ε3、ε4在组间的差异也有统计学意义，这提示，apoE基因多态性与脑梗死之间有直接关系。总之，脑梗死与apoE基因多态性相关关系的研究结果不一致，可能与样本例数、病例选择、环境、生活方式和遗传背景等诸多因素有关，有待我们以后做针对性的进一步研究。
(本文图1～2见PDF)
参考文献
[1] 王景华，宁宪嘉，卢红艳，等. 脑梗塞患者载脂蛋白E基因多态性特点研究. 中国综合临床，2006，22（2）：118－120.[2] 中华神经科学会，中华神经外科学会. 各类脑血管病诊断要点. 中华神经科杂志，1996，29（6）：379－380.
[3] 时宝庆，吕全军，李文杰，等. 载脂蛋白E基因多态性与老年人血脂、血压的相关性研究. 中国老年学杂志，2006，26（1）：19－21.
[4] Hixson JE，Vernier DT. Restriction isotyping of human apolipoprotein E by gene amplification and cleavage with HhaⅠ. J Lipid Res，1990，31（3）：545－548.[PubMed]
[5] 郭阳，郭津津，佡剑飞，等. 载脂蛋白E基因多态性与动脉粥样硬化性脑梗塞的关系. 中华神经科杂志，1997，30（4）：236－239.
[6] 陈峰，薛雅丽，黄承滨，等. 载脂蛋白E基因多态性在中国4个民族中的分布. 人类学学报，1999，18（4）：311－315.
[7] Chowdhury AH，Yokoyama T，Kokubo Y，et al. Apolipoprotein E genetic polymorphism and stroke subtypes in a Bangladeshi hospital-based study. J Epidemiol，2001，11（3）：131－138.[PubMed]
[8] 夏昱，李红乐，王继立. 载脂蛋白E基因多态性与脑梗塞及脂类代谢关系的研究. 中国病理生理杂志，2002，18（7）：826－829.
[9] 沈丽华，柯开富，李作汉，等. 载脂蛋白E基因多态性与脑梗死的相关性分析. 中风与神经疾病杂志，2003，20（5）：445－447.
[10] 陈卫蓉，肖志杰，谭利民，等. 载脂蛋白E基因多态性与老年冠心病和脑梗死的关系. 中华老年心脑血管病杂志，2005，7（2）：139.
[11] Pablos-Méndez A，Mayeux R，Ngai C，et al. Association of apo E polymorphism with plasma lipid levels in a multiethnic elderly population. Arterioscler Thromb Vasc Biol，1997，17（12）：3534－3541.[PubMed]
[12] Liu Y，Laakso MP，Karonen JO，et al. Apolipoprotein E polymorphism and acute ischemic stroke：a diffusion-and perfusion-weighted magnetic resonance imaging study. J Cereb Blood Flow Metab，2002，22（11）： 1336－1342.[PubMed]
[13] 张涌，黄萍，易继湖. 中国人载脂蛋白E基因多态性与脑梗死关系的Meta分析. 预防医学论坛，2005，11（4）：387－389.
[14] 陈燕，赵明，刘允桂，等. 心肌梗死患者及其同胞者血脂水平和ApoE基因分析. 中国实验诊断学，2003，7（4）：316－319.
[15] Nakata Y，Katsuya T，Rakugi H，et al. Polymorphism of angiotensin converting enzyme，angiotensinogen，and apolipoprotein E genes in a Japanese population with cerebrovascular disease. Am J Hypertens，1997，10（12 Pt 1）：1391－1395.[PubMed]
(编辑：戚红丹 收稿日期：2009-08-17)