尽管30年来体外受精和胚胎培养相关技术得到长足发展，人们已经能够根据胚胎形态学选择具有发育潜能的胚胎进行移植，但是依然存在部分患者反复胚胎种植失败。Margalioth等[1]提出经过2～6个周期，移植≥10个高质量胚胎仍未妊娠者定义为反复种植失败，美国反复种植失败发生率约19%。
在体外受精-胚胎移植（in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET）治疗中发现部分患者取卵术、胚胎移植过程中和（或）移植术后有阵发性下腹疼痛，提示存在子宫收缩现象。韩国学者通过记录子宫内膜收缩波提示反复种植失败与频繁的子宫收缩有关，经催产素拮抗剂治疗后子宫收缩波减弱，获得妊娠并分娩健康新生儿[2]。
目前还未见描述IVF-ET周期和妊娠早期血清催产素（oxytocin，OT）水平的资料。对于血清OT水平是否会影响IVF-ET结局及其与激素水平的关系尚不清楚。本文通过前瞻性、对比研究分析反复种植失败和第一次胚胎移植的患者在IVF-ET治疗不同时期血清OT、性激素水平等指标，探讨血清OT水平与胚胎反复种植失败的关系。
资料与方法
一、一般资料
2009年3月至5月在中山大学附属第一医院生殖医学中心行IVF-ET或卵细胞胞质内单精子显微注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）助孕治疗的44例患者。不孕原因包括双侧输卵管阻塞、子宫内膜异位症、原因不明不孕或男方少、弱精症。年龄为26～40岁，不孕年限2～14年。其中A组23例为第一次进行胚胎移植，B组21例为反复种植失败患者（两次或以上胚胎移植失败史）。
二、IVF-ET治疗
采用本中心常规促性腺激素释放激素激动剂/促性腺激素/人绒毛膜促性腺激素（GnRH-a/Gn/HCG）降调节方案超排卵治疗。于月经周期第3～5天给予肌内注射卵泡刺激素，150～450 IU/d诱导卵泡发育，采用阴道超声检查结合血清激素检测评估卵泡发育情况，于主导卵泡直径达到18 mm当天22时给予HCG 6 000～10 000 IU（Profasi，瑞士雪兰诺公司）肌内注射促卵子成熟。注射HCG后32～36 h，在阴道超声介导下取卵进行体外受精和培养，于卵母细胞受精第3天行胚胎移植。
三、黄体支持方案
取卵日开始应用HCG 2 000 IU，每三天一次，连续应用4次，或肌内注射黄体酮40 mg/d。胚胎移植后第14天尿妊娠试验阳性者于胚胎移植第5周阴道超声检查有胚囊或胎心搏动者确定为临床妊娠，随即进入妊娠组，其余为非妊娠组。
四、OT与激素测定
分别在Gn启动日、HCG注射日、ET日、ET后第5天上午9～10时抽静脉血测定激素水平，并另外留取3 ml血，3 500 r/min离心后取血清，5 min后保存于－20 ℃冰箱内待测定用。采用化学发光定量法测定血清卵泡刺激素（FSH）、黄体生成素（LH）、雌二醇（E2）、孕酮（P）水平；ELISA方法测定血清OT水平（催产素酶联免疫吸附试剂盒ADLITTERAM DIAGNOSTIC LABORATORIES）。
五、统计学处理
采用SPSS 13.0软件进行统计学分析。计量资料比较采用t检验或t′检验；计数资料比较采用χ2检验。
结 果
一、第一次移植胚胎组与反复种植失败组的比较
1. 两组基础指标比较（表1）：年龄、体重指数（BMI），基础FSH、LH、E2水平等均差异无统计学意义（P＞0.05）。
表1 两组患者基础指标比较
|
组别
|
例数
|
年龄（岁）
|
BMI（kg/m2）
|
FSH（IU/L）
|
LH （IU/L）
|
E2（pg/ml）
|
|
A组
|
23
|
31.69±4.14
|
20.99±1.80
|
5.33±1.42
|
4.21±1.69
|
37.69±10.81
|
|
B组
|
21
|
33.57±4.55
|
21.17±2.25
|
5.32±1.47
|
3.58±1.64
|
41.86±10.73
|
|
P值
|
|
＞0.05
|
＞0.05
|
＞0.05
|
＞0.05
|
＞0.05
|
2. 两组血清OT水平比较（表2）：B组HCG注射日和ET日OT水平均显著高于A组（均P＝0.03），ET后第5天两组OT水平差异无统计学意义。
表2 两组患者不同时间点血清OT水平比较（ng/ml，
）
）|
组别
|
例数
|
Gn启动日
|
HCG注射日
|
ET日
|
ET后第5天
|
|
A组
|
23
|
96.99±63.64
|
64.73±29.22
|
61.75±22.34
|
67.62±50.80
|
|
B组
|
21
|
96.01±35.65
|
88.28±36.22
|
86.99±42.61
|
85.77±35.78
|
|
P值
|
|
＞0.05
|
0.03
|
0.03
|
＞0.05
|
3. 两组血清激素FSH、LH、E2、P的比较（表3）：B组Gn启动日E2水平均显著高于A组，而ET日E2水平显著低于A组（均P＝0.02）；其余差异无统计学意义。
表3 两组患者不同时间点血清激素FSH、LH、E2、P水平的比较
|
组别
|
例数
|
Gn启动日
|
|
HCG注射日
|
||||||||||||
|
FSH（IU/L）
|
LH （IU/L）
|
E2（pg/ml）
|
|
FSH（IU/L）
|
LH（IU/L）
|
E2（pg/ml）
|
P（ng/ml）
|
|||||||||
|
A组
|
23
|
2.09±1.30
|
2.02±1.26
|
21.00±5.70
|
|
9.51±3.37
|
1.30±1.06
|
3033.91±1419.41
|
0.45±0.26
|
|||||||
|
B组
|
21
|
3.16±2.53
|
1.75±1.17
|
30.29±15.56
|
|
10.24±3.84
|
1.44±1.19
|
2387.76±1318.56
|
0.54±0.29
|
|||||||
|
P 值
|
|
＞0.05
|
＞0.05
|
0.02
|
|
＞0.05
|
＞0.05
|
＞0.05
|
＞0.05
|
|||||||
|
组别
|
ET日
|
|
ET后第5天
|
|||||||||||||
|
LH（IU/L）
|
E2（pg/ml）
|
P（ng/ml）
|
|
LH（IU/L）
|
E2（pg/ml）
|
P（ng/ml）
|
||||||||||
|
A组
|
0.36±0.29
|
1618.09±1043.48
|
119.99±112.86
|
|
0.30±0.29
|
1328.96±933.71
|
82.37±67.90
|
|||||||||
|
B组
|
0.31±0.21
|
995.86±584.16
|
87.60±43.47
|
|
0.19±0.19
|
1166.62±680.10
|
100.62±62.21
|
|||||||||
|
P 值
|
＞0.05
|
0.02
|
＞0.05
|
|
＞0.05
|
＞0.05
|
＞0.05
|
|||||||||
二、妊娠和非妊娠组的比较
妊娠组23例中反复种植失败患者8例，占34.8%，非妊娠组21例中反复种植失败患者13例，占61.9%。
1. 两组基础指标比较（表4）：两组在年龄、BMI、基础FSH、LH、E2等参数的比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。
表4 妊娠组和非妊娠组患者的基础指标比较
|
组别
|
例数
|
年龄（岁）
|
BMI（kg/m2）
|
FSH（IU/L）
|
LH（IU/L）
|
E2（pg/ml）
|
|
妊娠组
|
23
|
31.39±3.53
|
21.24±2.04
|
5.13±1.39
|
3.53±1.44
|
37.26±11.43
|
|
非妊娠组
|
21
|
33.90±4.55
|
20.89±2.00
|
5.54±1.48
|
4.31±1.86
|
42.62±9.61
|
|
P值
|
|
＞0.05
|
＞0.05
|
＞0.05
|
＞0.05
|
＞0.05
|
2. 两组血清OT水平比较（表5）：妊娠组在Gn启动日、HCG注射日、ET日、ET后第5天均显著低于非妊娠组。
）|
组别
|
例数
|
Gn启动日
|
HCG注射日
|
ET日
|
ET后第5天
|
|
妊娠组
|
23
|
74.82±22.29
|
65.33±29.38
|
61.94±21.79
|
63.97±16.96
|
|
非妊娠组
|
21
|
123.33±75.52
|
101.91±54.11
|
92.66±43.78
|
103.65±47.29
|
|
P值
|
|
0.02
|
0.02
|
0.01
|
＜0.01
|
3. 两组血清激素水平的比较（表6）：两组在Gn启动日、HCG注射日、ET日、ET后第5天差异均无统计学意义（P＞0.05）。
表6 妊娠组和非妊娠组患者不同时间点血清激素水平的比较
|
组别
|
例数
|
Gn启动日
|
|
HCG注射日
|
||||||||||||
|
FSH（IU/L）
|
LH （IU/L）
|
E2（pg/ml）
|
|
FSH（IU/L）
|
LH（IU/L）
|
E2（pg/ml）
|
P（ng/ml）
|
|||||||||
|
妊娠组
|
23
|
2.11±1.30
|
1.73±1.26
|
27.00±14.11
|
|
9.23±3.33
|
1.46±1.10
|
2666.26±1472.86
|
0.49±0.28
|
|||||||
|
非妊娠组
|
21
|
3.13±2.55
|
2.07±1.16
|
23.67±9.97
|
|
10.55±3.78
|
1.26±1.15
|
2790.43±1337.61
|
0.57±0.29
|
|||||||
|
P值
|
|
＞0.05
|
＞0.05
|
＞0.05
|
|
＞0.05
|
＞0.05
|
＞0.05
|
＞0.05
|
|||||||
|
组别
|
ET日
|
|
ET后第5天
|
|||||||||||||
|
LH（IU/L）
|
E2（pg/ml）
|
P（ng/ml）
|
|
LH（IU/L）
|
E2（pg/ml）
|
P（ng/ml）
|
||||||||||
|
妊娠组
|
0.34±0.29
|
1435.26±1112.35
|
118.34±115.04
|
|
0.26±0.28
|
1305.57±879.92
|
86.18±64.97
|
|||||||||
|
非妊娠组
|
0.34±0.21
|
1196.19±599.19
|
89.41±38.19
|
|
0.23±0.21
|
1192.24±759.78
|
96.45±66.51
|
|||||||||
|
P值
|
＞0.05
|
＞0.05
|
＞0.05
|
|
＞0.05
|
＞0.05
|
＞0.05
|
|||||||||
讨 论
尽管IVF-ET作为人类辅助生殖技术应用以来为广大不孕夫妇带来了福音，试管婴儿在世界各地不断诞生。但是该技术长期存在着低水平的妊娠率和较高的胚胎丢失现象，其发生机制一直是生殖生物学和助孕技术领域研究的难点与热点。
允许胚胎种植的子宫环境包括及时出现的具有接受态的子宫内膜、足够的子宫内膜血液灌流和安静的子宫。刺激子宫收缩将会导致胚胎从宫腔中排出。Poindexter等[3]采用导管冲洗方法观察胚胎移植术后1 h胚胎的去向，结果发现45%的胚胎停留在子宫腔内，15%的胚胎在阴道内找到。笔者认为移植术后胚胎的丢失与导管刺激子宫引起反射性收缩将胚胎排出宫腔有关。
一、血清OT水平与子宫收缩
OT是有胎盘哺乳类动物体内的一种9肽神经内分泌激素，主要由下丘脑的OT神经元合成，沿其轴突运输并贮存到垂体后叶，在适当的刺激下以脉冲形式释放进入血液循环。其在体内的主要生理作用包括临产促进子宫平滑肌收缩，哺乳期促使乳腺腺泡的肌上皮细胞收缩，参与黄体形成、退化以及在中枢神经系统中调节母性行为等。血清中OT水平的升高还将导致子宫蜕膜细胞花生四烯酸和前列腺素F2α的生成，从而增强子宫收缩[4]。
杨俊等[5]报道采用放射免疫法测定正常女性自然周期血清OT水平，16～30岁组为（8.9±0.3）ng/L，31～40岁为（12.3±0.7）ng/L。本研究中采用酶联免疫吸附法测定IVF-ET治疗周期中OT水平，结果显示超排卵周期OT水平显著高于自然周期水平，与文献[5]结论相符，提示在IVF-ET周期中存在高水平OT引起子宫收缩增强的因素。Pierzynski等[2]报道1例7次优质胚胎移植失败、子宫腔检查正常的患者，在第8次胚胎移植前1 h记录到高频率、高幅度子宫内膜收缩波，应用OT受体拮抗剂后静脉滴注治疗后3 h子宫内膜收缩波频率和幅度明显降低，并成功妊娠分娩一对正常新生儿。Serradeil-Le等[6]认为OT受体阻滞在减少子宫收缩的同时还减少了前列腺素类物质的产生，从而进一步减弱子宫内膜收缩波，增加了胚胎种植的机会。
二、血清OT水平与胚胎种植
动物实验中发现在马的子宫颈插入移植管类似于刺激宫颈，将引起血清OT水平的显著升高，在排卵后第5天和第7天实验组分别是（858.4±469.9）pg·ml－1·h－1和（411.9±231.0）pg·ml－1·h－1，显著高于对照组的（186±98）pg·ml－1·h－1和（156±23.5）pg·ml－1·h－1[7]。在牛的实验中发现肌肉注射OT会刺激子宫前列腺素F2α的产生，减少子宫内膜血流和影响胚胎的存活[8]。
本研究通过比较两组患者IVF-ET周期中血清OT水平的变化，发现反复种植失败组HCG注射日、ET日OT水平均显著高于第一次胚胎移植组（P＝0.03），提示在反复种植失败妇女中存在OT水平升高的现象，提示高水平的OT与其反复胚胎种植失败存在相关性。进一步分析妊娠组和非妊娠组资料发现非妊娠组在Gn启动日、HCG注射日、ET日、ET后第5天血清OT水平均显著高于妊娠组。提示血清高水平OT不利于胚胎种植。
三、血清激素水平与OT分泌的调节
文献报道雌激素上调小鼠子宫OT受体的表达，而孕激素呈剂量依赖性地下调OT与其受体的结合[9]。在IVF-ET治疗周期中，控制性超排卵刺激中带来了高雌激素水平，从而可能导致患者子宫OT受体水平的增高[10]。本研究中妊娠组和非妊娠组在Gn启动日、HCG注射日、ET日、ET后第5天的FSH、LH、E2和P激素水平比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。进一步对不同时间点血清OT水平与患者年龄、雌激素、孕激素水平进行了多重线性回归分析，但回归方程不成立，不能得出雌、孕激素水平与OT水平的相关关系。是否需要扩大样本例数还需考虑。
本研究首次报道了IVF-ET周期中反复种植失败患者和第一次胚胎移植患者血清OT水平的变化。结果提示在反复失败患者中存在血清OT水平升高的现象，可能是其反复胚胎种植失败的重要原因之一。但能否通过OT受体拮抗剂来治疗，还需要前瞻性对比研究。
参考文献
[1] Margalioth EJ，Ben-Chetrit A，Gal M. Investigation and treatment of repeated implantation failure following IVF-ET. Hum Reprod，2006，21（12）：3036－3043.[PubMed][2] Pierzynski P，Reinheimer TM，Kuczynski W. Oxytocin antagonists may improve infertility treatment. Fertil Steril，2007，88（1）：213.e19－e22.[PubMed]
[3] Poindexter AN 3rd，Thompson DJ，Gibbons WE. Residual embryos in failed embryo transfer. Fertil Steril，1986，46（2）：262－267.[PubMed]
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[5] 杨俊，黄祖汉. 催产素的放射免疫分析. 放射免疫学杂志，1993，6（4）：219－220.
[6] Serradeil-Le Gal C，Valette G，Foulon L，et al. SSR126768A（4-chloro-3-[（3R）-（+）-5-chloro-1-（2，4-dimethoxybenzyl）-3-methyl-2-oxo-2，3-dihydro-1H-indol-3-yl]-N-ethyl-N-（3-pyridylmethyl）-benzamide，hydrochloride）：a new selective and orally active oxytocin receptor antagonist for the prevention of preterm labor. J Pharmacol Exp Ther，2004，309（1）：414¬¬－424.[PubMed]
[7] Handler J，Konigshofer M，Kindahl H，et al. Secretion patterns of oxytocin and PGF2alpha-metabolite in response to cervical dilatation in cyclic mares. Theriogenology，2003，59（5/6）：1381－1391.[PubMed]
[8] Lemaster JW，Seals RC，Hopkins FM，et al. Effects of administration of oxytocin on embryonic survival in progestogen supplemented cattle. Prostaglandins Other Lipid Mediat，1999，57（4）：259－268.[PubMed]
[9] Beretsos P，Loutradis D，Koussoulakos S，et al. Oxytocin receptor is differentially expressed in mouse endometrium and embryo during blastocyst implantation. Ann N Y Acad Sci，2006，1092：466－479.[PubMed]
[10] Richter ON，Kübler K，Schmolling J，et al. Oxytocin receptor gene expression of estrogen-stimulated human myometrium in extracorporeally perfused non-pregnant uteri. Mol Hum Reprod，2004，10（5）：339－346.[PubMed]
(编辑：丁海燕 收稿日期：2009-07-09)