中华临床医师杂志（电子版） 2009年12月,3卷12期

论　著

结核分枝杆菌临床分离株对三种氟喹诺酮类药物的敏感性分析研究

崔振玲，王洁，陆俊梅，汪小黎，胡忠义

崔振玲、王洁、陆俊梅、汪小黎、胡忠义，同济大学附属上海市肺科医院 上海市结核病（肺）重点实验室，200433

摘要:目的　对结核分枝杆菌（MTB）临床分离株对氧氟沙星（OFX）、左氧氟沙星（LFX）和莫西沙星（MFX）三种临床常用的氟喹诺酮类药物的敏感性进行分析研究，为临床用药提供依据。方法　本研究采用液体培养基联合MTT技术进行抗结核药物的最低抑菌浓度（MIC）检测。对来自我院不同结核病患者的163株MTB临床分离株进行OFX、LFX、MFX三种药物的MIC检测和Bactec MGIT 960药敏检测。结果　163株中OFX耐药株占35.6%；耐多药（MDR）结核菌株中，OFX耐药率为73.5%，MDR菌株中LFX耐药率超过一半以上；所有MTB菌株MFX的MIC值均≤1 μg/ml。结论　目前在MTB临床分离株中，OFX和LFX已出现较高的耐药率，值得引起临床医生的重视，MFX在MDR结核和广泛耐药（XDR）结核中显示出良好的抗菌效果，给MDR结核病的治疗带来希望。

关键词:分枝杆菌，结核；　微生物敏感性试验；　氧氟沙星；　莫西沙星

基金项目：国家十一五传染病重大专项（2008ZX10003-02）；上海市科委课题（09415801800）；上海市卫生局课题（2008067；2007Y59）

Evaluation of drug susceptibility of three kinds of fluoroquinolines on mycobacterium tuberculosis clinical isolates

CUI Zhen-ling，WANG Jie，LU Jun-mei，WANG Xiao-li，HU Zhong-yi.

Shanghai Key Laboratory of Tuberculosis，Shanghai Pulmonary Hospital Affiliated to Tongji University，Shanghai 200433，China

Abstract:Objective　To study the antimicrobial effect of three kinds of fluoroquinolones，ofloxacin （OFX），levofloxacin（LFX）and moxifloxacin（MFX），on mycobacterium tuberculosis clinical isolates for effective clinical use. Methods　Liquid culture and MTT test were used in MIC test.MICs of three kinds of fluoroquinolones of 163 MTB strains from clinical isolates were detected. Results　There were 35.6% MTB strains resistant to OFX in all strains and 73.5% MTB strains resistant to OFX in multidrug MTB strains. There were more than one half strains resistant to LFX. MICs of all strains were equal or lesser than 1 μg/ml. Conclusions　There are highly resistant ratio of OFX and LFX in MTB clinical isolates. The clinical doctors need pay more attention on this phenomenon. MFX shows best antimicrobial effect and bring hope to multidrug TB patients.

Keywords:Mycobacterium tuberculosis；　Microbial sensitivity tests；　Ofloxacin；　Moxifloxacin

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　　耐多药（MDR）/广泛耐药（XDR）结核病的出现和蔓延，严重阻碍了中国结核病防治工作的进程，已成为严重的公共卫生和社会问题[1-2]。氟喹诺酮类药物在长期临床应用中因其耐受性较其他“二线”抗结核药更优被广泛使用，在耐药结核治疗中担当重要的角色[3-5]。但是随着氟喹诺酮类药物在抗结核药物中的广泛使用，其耐药性也逐渐显现出来，本研究将近期临床收集到的结核分枝杆菌（MTB）临床分离株对氧氟沙星（OFX）、左氧氟沙星（LFX）和莫西沙星（MFX）三种临床常用的氟喹诺酮类药物的敏感性进行了研究分析，供临床医生用药参考。
 
材料与方法
　　1. 菌株：MTB标准株（H37Rv ATCC27294）购自国家菌种保藏中心，163株MTB临床分离株为上海市肺科医院2009年1～6月所有进行MGIT 960药敏检测的MTB临床分离株，经常规生化鉴定和分子生物学鉴定为MTB。
　　2. 试剂：OFX购自Sigma公司；LFX购自Fluka公司；MFX氯化钠注射液购自拜耳公司；3-[4，5-二甲基噻唑-2-一价烃基]-2，5-溴化二苯基四唑（MTT）购自Sigma公司；Middlebrook 7H9、酪蛋白胨购自DIFCO公司；甘油、白蛋白、葡萄糖和过氧化氢酶购自Sigma公司；Bactec 960试剂，购自Becton Dickinson公司。
　　3. 耗材仪器：0.22 μm无菌滤器，MILLPORE公司；61010A-1型比浊仪，MGIT 960检测仪，购自Becton Dickinson公司；GNP-9270隔水式培养箱，购自上海精宏实验设备有限公司。
　　4. 7H9-S液体培养基配制：Middlebrook 7H9液体培养基，0.1%酪蛋白胨，0.5%甘油，加入10%油酸，牛血清白蛋白，葡萄糖和过氧化氢酶（OADC）添加剂[6]。
　　5. 试剂配制：OFX和LFX用0.1 mol/L NaOH溶解，MFX直接使用注射液，分装保存于－70 ℃备用。MTT用pH 6.8的磷酸缓冲液（PBS）溶解配制成5 mg/ml，0.22 μm无菌滤器过滤除菌后置于4 ℃避光保存备用。
　　6. 最低抑菌浓度（MIC）检测方法及药物浓度设置参见文献[6-8]并根据预实验结果设定为：OFX 0.125～32 μg/ml，LFX 0.125～32 μg/ml，MFX 0.063～4 μg/ml。
　　7. MGIT 960检测：链霉素、异烟肼、利福平和乙胺丁醇按照MGIT 960的说明执行，阿米卡星、卷曲霉素和OFX按照参考文献[9]执行。
　　8. 质控：H37Rv作为每次试验的质控株。
　　9. 数据统计分析：数据比较采用非参数检验，使用软件MedCalc对所有检测结果进行分析。
 
结　　果
　　1. 163株MTB临床分离株的OFX MGIT 960检测结果：OFX敏感株105株，耐药株58株（35.6%）；不同耐药情况下，OFX耐药株数及比例见表1。71株一线抗结核药物和两种二线抗结核注射类药物全敏的MTB菌株中2株为OFX耐药株，其MIC值分别为2 μg/ml和0.5 μg/ml，69株OFX敏感株的最高MIC值为2 μg/ml，LFX的最高MIC值为1 μg/ml，MFX的最高MIC值为0.25 μg/ml。79株一线抗结核药物全敏株中的3株为OFX耐药株，其MIC值分别为4 μg/ml、2 μg/ml和0.5 μg/ml。
 
表1　不同耐药情况下OFX耐药株的数量及耐药率表
不同耐药情况
菌株总数
OFX耐药株数
OFX耐药率（%）
OFX最大
MIC（μg/ml）
LFX最大MIC
（μg/ml）
MFX最大MIC
（μg/ml）
全敏株
71
2
2.8
2
1
0.5
任一药物单耐
12
1
8.3
2
1
0.5
任2种药物耐药
11
4
36.4
4
4
0.5
任3种药物耐药
19
9
47.4
≥64
16
1
任4种药物耐药
23
17
73.9
≥64
≥64
1
任5种药物耐药
8
7
87.5
≥64
4
1
6种药物全耐
19
18
94.7
≥64
≥64
1
多耐药a
24
6
25
≥64
8
1
MDR
68
50
73.5
≥64
≥64
1
一线药物全耐b
45
38
84.4
≥64
≥64
1
一线药物全敏
79
3
3.8
4
4
0.5
两种二线注射药
物任一耐药c
38
28
73.7
≥64
≥64
1
　　注：a多耐药指MDR之外的所有耐药菌株；b一线药物全耐的MTB株包括二线药物敏感和耐药的菌株；c两种注射类抗结核药物任一耐药株包括一线药物敏感和耐药的菌株
 
　　2. 68株MDR-MTB菌株三种药物的MIC检测结果（表2）：OFX中MIC≥8 μg/ml的菌株23株（33.8%），LFX中MIC≥4 μg/ml的菌株34株（50%），OFX与LFX、OFX与MFX、LFX与MFX的秩和检验P值均＜0.05。
 
表2　68株MDR-MTB菌株在三种药物不同药物浓度下的MIC分布表（株）
药物
0.0625 μg/ml
0.125 μg/ml
0.25 μg/ml
0.5 μg/ml
1 μg/ml
2 μg/ml
4 μg/ml
8 μg/ml
16 μg/ml
32 μg/ml
≥64 μg/ml
OFX
-
3a
5
7
6
10
14
13
4
1
5
LFX
-
4a
10
7
7
9
24
3
4
0
3
MFX
15a
11
6
15
21
0
0
-
-
-
-
　　注：-表示未进行MIC检测；a表示MIC值≤所对应的药物浓度
 
　　3. 163株MTB临床分离株中XDR-MTB菌株26株，XDR-MTB菌株三种药物的MIC检测结果（表3）：OFX中MIC≥8 μg/ml的菌株有14株（53.8%），LFX中MIC≥4 μg/ml的菌株有34株（69.2%），OFX与LFX、OFX与MFX、LFX与MFX的秩和检验P值均＜0.05。
 
表3　26株XDR-MTB菌株在三种药物不同药物浓度下的MIC分布表（株）
药物
0.0625 μg/ml
0.125 μg/ml
0.25 μg/ml
0.5 μg/ml
1 μg/ml
2 μg/ml
4 μg/ml
8 μg/ml
16 μg/ml
32 μg/ml
≥64 μg/ml
OFX
-
0
0
0
2
5
5
8
2
1
3
LFX
-
0
0
3
3
2
14
0
3
0
1
MFX
1a
4
2
6
13
0
0
-
-
-
-
　　注：-表示未进行MIC检测；a表示MIC值≤所对应的药物浓度
 
讨　　论
　　氟喹诺酮类药物是一类重要的抗结核药物，耐受性优于二线抗结核药物，被称为第三线抗结核药物。氟喹诺酮类药物的药理作用在于抑制细菌DNA回旋酶，从而抑制细菌的DNA复制、转录，造成染色体损害，导致细菌死亡。此类药物用于抗结核治疗在我国已有十多年的历史，氟喹诺酮类药物因其与一二线抗结核药物的作用机制不同，又与原有抗结核药物无交叉耐药的特点，在耐药结核病领域被广泛使用[10]。
　　随着氟喹诺酮类药物的广泛使用，其耐药性也逐渐显现出来，如目前出现的XDR-MTB就是一类对氟喹诺酮类药物耐药的结核菌。我国2007～2008年在全国范围开展的结核病耐药基线调查结果显示，肺结核病患者中MDR率为8.32%，耐药率为0.68%[1]。在如此严峻的耐药形式下，氟喹诺酮类药物对MTB临床分离株的抗菌效果如何非常值得研究，研究结果可为临床用药提供参考。
　　我院结核科主要收治来自上海周边省市及部分其他省市的结核病患者，以耐药结核病患者为主。本研究所用菌株均来自我院住院患者的临床标本分离株，为连续时间段内所有MGIT 960药敏检测菌株，整群抽样结果具有代表性。本研究对上述样本同步进行了MGIT 960药敏检测和MIC值检测。
　　本研究中在全部的163株MTB临床分离株中，OFX耐药比例非常高，仅次于4种一线抗结核药物的耐药率（本研究中4种一线药物利福平、异烟肼、链霉素、乙胺丁醇的耐药率分别为41.7%、49.7%、38.0%和36.8%），显示了目前OFX耐药的严峻形势。随着MTB临床分离株对其他6种一二线抗结核药物耐药种类的增多，OFX的耐药率也呈上升趋势，其中6种药物全耐的菌株OFX的耐药率最高，其次是MDR菌株，多耐药菌株的耐药率远远低于MDR菌株，说明OFX耐药株主要存在于MDR中，且通过MDR-MTB的OFX的MIC检测结果可以看出，三分之一菌株的OFX具有较高的耐药性（MIC≥8 μg/ml），提示在耐药结核的治疗中，不能盲目使用OFX，应对OFX耐药性引起充分重视，需进行及时的药敏检测结合药敏结果合理用药，从而降低无意义的治疗成本。
　　LFX和MFX是继OFX后开发的两种氟喹诺酮类药物，本研究显示在6种药物全敏的MTB临床分离株，LFX和MFX的MIC值均明显低于OFX，且三种药物最高的MIC值，OFX是LFX的2倍，LFX是MFX的2倍，三种药物对MTB敏感株均显示了较好的抑菌效果。一线抗结核药物全敏的菌株中，仍有1株菌株的OFX和LFX出现较高的耐药MIC值，其耐药原因尚待于进一步探讨，但是也提示我们，即使一线全敏的菌株也有氟喹诺酮类药物耐药的菌株存在，因此在临床用药中应谨慎使用该类药物，防止不规范用药导致耐药的出现。而MDR-MTB中，除了OFX出现了较高的耐药性外，LFX也显示出较高的耐药性，一半菌株的MIC值≥4 μg/ml。虽然本研究中未对LFX的药敏进行MGIT 960检测，但是如果根据Sanders等[11]报道的LFX药敏检测中2 μg/ml的临界浓度作为判断LFX敏感耐药依据，则有超过50%的菌株出现LFX耐药性，因此尽管在MDR-MTB中从MIC值分析LFX的抗菌效果优于OFX，但是在MDR-MTB中，出现较高比例的LFX耐药菌株已成为无可置疑的事实，在XDR-MTB中OFX和LFX的耐药情况同样十分严重，超过一半的菌株为耐药株。长期以来OFX和LFX是作为治疗耐药结核病的有效药物在临床上使用，但是本研究显示这两种药物的抗结核菌效果却不容乐观，需要广大的临床医生引起重视，合理的使用这两种药物，防止更多的耐药MTB出现。
　　MFX作为氟喹诺酮类药物家族中最新的一种药物，所有的耐药结核菌对MFX表现出较好的体外药物敏感性，其体外药物敏感性明显优于OFX和LFX，且本研究中所有MTB临床分离株的MIC值均≤1 μg/ml。因此，在治疗结核特别是MDR-TB和XDR-TB中MFX是一种非常有前途的药物，给耐药结核病的治疗带来希望。

参考文献

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[2]　唐神结，肖和平. 严重耐药结核病的研究进展. 中华结核与呼吸杂志，2009，32（5）：380－383.
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[5]　陆宇，朱莉贞，段连山. 氟喹诺酮类药物的抗结核作用. 中华结核和呼吸杂志，1999，22（11）：694－696.
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[10]　彭卫生，王英年，肖成志. 新编结核病学. 北京：中国医药科技出版社，2003：463－465.
[11]　Sanders CA，Nieda RR，Desmond EP. Validation of the use of Middlebrook 7H10 agar，BACTEC MGIT 960，and BACTEC 460 12B media for testing the susceptibility of Mycobacterium tuberculosis to levofloxacin. J Clin Microbiol，2004，42（11）：5225－5228.[PubMed]
(编辑：戚红丹 收稿日期：2009-10-09)