前列腺癌是老年男性最常见的肿瘤之一，其发病率在全球范围内呈上升趋势，美国癌症学会（ACS）预期2007年美国前列腺癌新发病例约占男性癌症新发病例的29%，死亡病例约占男性癌症相关死亡病例的9%，是美国男性癌症的第三大死因[1]。NSBP1是King等[2]从骨髓间充质干细胞（BMSC）的cDNA文库中发现了的新基因，命名为核小体结合蛋白1（nucleosomal binding protein-1，NSBP1）基因。本课题组前期应用改进的mRNA差异显示技术，从前列腺癌组织和正常前列腺组织中获得两者的差异片段[3]。通过网上核苷酸比对发现其中一个片段与已知NSBP1基因[2]高度同源（97%），并在mRNA和蛋白水平上进行了初步验证[4-5]。本研究中，我们探讨重组慢病毒介导的人NSBP1基因沉默对非激素依赖性前列腺癌细胞系DU145移植瘤生长的抑制作用及机制。
材料和方法
1. 材料：前列腺癌细胞系DU145由北京大学泌尿外科研究所提供。细胞系从液氮中取出复苏后，置于5% CO2 37 ℃环境下在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中培养。NSBP1的siRNA重组慢病毒（NSBP1-RNAi-lentivirus）和阴性对照慢病毒由上海吉凯基因公司提供，上海博雅生物技术有限公司测序。病毒滴度为2×108 TU/ml，NSBP1的shRNA靶序列：5′-CACAGCCTTTCTTTAGCAT-3′（NSBP1 mRNA第1008位，GenBank gi：NM_030763）。Trizol，购自Invitrogen公司。兔抗人NSBP1多克隆抗体由北京博奥森生物公司制备，cyclinB1和Bcl-2兔抗人多克隆抗体及山羊抗兔IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
2. 裸鼠异种接种实验：实验用BALB/c裸小鼠，4～6周龄，雄性，北京大学医学部实验动物中心提供，在恒温（25 ℃～27 ℃）、恒湿（45%～50%）的屏障系统环境下饲养。灭菌处理的饲料和水供动物自由摄入。用NSBP1-RNAi-lentivirus和阴性对照慢病毒转染DU145细胞[感染复数（MOI）为10∶1]，置于5% CO2 37 ℃环境下培养。取对数生长期细胞，胰酶消化后行活细胞计数，调整细胞浓度至5×106个/ml，每只裸鼠颈背部皮下注射0.2 ml（含细胞1×106个）。自接种日起每周观察2次，连续34 d，测量肿瘤大小，并根据公式（体积＝长径×短径2×0.5）计算肿瘤体积（V），肿瘤抑制率（%）＝1－（V对照组－V抑制组）/V对照组×100%。第34天后处死裸鼠，取部分肿瘤组织放入液氮中保存，以备提取组织RNA和蛋白。
3. 实时RT-PCR检测NSBP1、cyclinB1和Blc-2的mRNA表达：按Trizol试剂盒说明一步法提取组织总RNA，紫外分光光度仪测定RNA纯度和浓度。反转录反应合成第一链cDNA，进行PCR扩增。
NSBP1检测所用上下游引物（PCR产物长148 bp）：上游 5′-GCAGTCAGGCAGTGACTGCCTTCG-3′；下游5′-CCCTTTTCTGTGGCATCTTC-3′；探针5′-CAGTTGTTGAAGAAGACTACAAT-3′。
GAPDH检测所用上下游引物（PCR产物长110 bp）：上游5′-CAGTCAGCCGCATCTTCTTTT-3′；下游：5′-GTGACCAGGCGCCCAATAC-3′；探针：5′-CGTCGCCAGCCGAGCCACA-3′。
Bcl-2检测所用上下游引物（PCR产物长125 bp）：上游 5′-GGGAGGATTGTGGCCTTCTT-3′；下游：5′-TCATCCACAGGGCGATGTT-3′；探针：5′-TCAACCGGGAGATGTCGCCCC-3′。
cyclinB1检测所用上下游引物（PCR产物长127 bp）：上游5′-AGCCTGTTAAAGAAGAAAAACTTTCG-3′；下游：5′-ATTACATCAGAGAAAGCCTGACACA-3′；探针：5′-ATACTGCCTCTCCAAGCCCAATGGAAAC-3′。
PCR反应条件为预变性94 ℃ 5 min；循环扩增参数：94 ℃ 30 s→55.5 ℃ 30 s→72 ℃ 60 s，40个循环。以GAPDH为内参照，以显示上样量的一致性。
4. Western blot检测NSBP1、cyclinB1和Bcl-2的蛋白表达：取黄豆大小组织，在液氮中研碎，然后置入匀浆器中，放置冰上。加入RIPA组织裂解液，冰浴30 min，4 ℃ 10 000 r/min离心10 min，收集上清，考马斯亮蓝定量。取50 g总蛋白进行SDS-PAGE电泳，转膜后，5%脱脂奶粉封闭，1∶200稀释的一抗4 ℃孵育过夜，TTBS洗膜后加二抗辣根过氧化物酶标记的IgG，37 ℃温育2 h，洗膜后加入ECL试剂，在X线胶片上曝光，显影，定影。用Lab Work 4.5分析软件测定Western blot条带的吸光度值，与β-actin吸光度值的比值表示蛋白的相对含量。
5. 统计学处理：所有数据以均数±标准差
表示。采用SPSS 13.0分析软件进行统计学处理。以单因素方差分析（ANOVA）检验组间差异，P＜0.05为差异有统计学意义。
表示。采用SPSS 13.0分析软件进行统计学处理。以单因素方差分析（ANOVA）检验组间差异，P＜0.05为差异有统计学意义。结 果
1. 裸鼠成瘤情况及生长曲线测定肿瘤的生长：空白对照组、阴性对照组和抑制组的DU145细胞接种于裸鼠颈背部皮下，各组裸鼠成瘤潜伏期在6～8 d，差异无统计学意义。裸鼠异种接种成瘤率均为8/8（100%）。肿瘤生长曲线显示，转染慢病毒NSBP1-RNAi-lentivirus组的裸鼠肿瘤的生长速度显著慢于阴性对照组和空白对照组，这种生长受抑制的情况从接种后第10天开始，到第34天处死裸鼠取出组织，三组肿瘤的平均体积分别为（281.5±11.44）mm3、（468.75±13.07）mm3、（477.25±13.76）mm3，差异具有统计学意义（P＜0.01）（图1）。
2. 实时RT-PCR 检测裸鼠肿瘤组织中NSBP1、cyclinB1、Bcl-2的mRNA水平的变化：与空白对照组和阴性对照组相比，抑制组的肿瘤组织内NSBP1的mRNA水平明显降低，抑制效率为72.2%，差异有统计学意义（P＜0.05）。随着NSBP1的表达降低，cyclinB1、Bcl-2 mRNA表达分别降低了29.1%和56.8%，差异具有统计学意义（P＜0.05）。
3. Western bolt检测裸鼠肿瘤组织中NSBP1、 cyclinB1、Bcl-2的蛋白水平变化：结果证实转染NSBP1-RNAi-lentivirus抑制组的肿瘤组织内 NSBP1的蛋白水平比对照组低，抑制效率为75.1%（P＜0.05）。在裸鼠肿瘤组织中，NSBP1的蛋白表达降低后，cyclinB1、Bcl-2的蛋白表达分别降低了26.8%和45.3%（图2）。
讨 论
NSBP1定位在Xq13.3，cDNA全长为1 865 bp，其中开放读码框（open reading frame，ORF）为846 bp，由6个外显子、5个内含子组成，是HMG家族HMGN中的一员[2]。HMGN 家族包括HMGN1 和HMGN2（原HMG-14 和HMG-17），它们在几乎所有哺乳动物和多数脊椎动物的细胞核中广泛存在[6]。HMGN是目前已知唯一可以特异识别146 bp核小体核心颗粒的核蛋白，在核内快速地运动，不断和核小体发生碰撞，一旦达到特异性的位点，就发生结合，从而进一步对染色质的结构进行修饰，并使调节蛋白（激活或抑制）发生聚集[7]。HMGN或者通过组蛋白的修饰或染色质因子的限制，或者受相互作用的其他蛋白质的影响结合特异的染色质构型，改变染色质的结构，增强染色质模板的转录和复制[8-9]。目前NSBP1的功能还不明确，我们推测NSBP1能与染色质结合，可能有促进染色质高级结构的打开、增强基因转录的功能。
本课题组前期半定量RT-PCR结果显示在前列腺癌细胞系LNCaP、DU145及PC3中NSBP1 mRNA的表达水平分别高于正常前列腺组织2.5倍、3.4倍和3.6倍，且抑制NSBP1的表达能够抑制LNCaP和PC3细胞的生长[4，10-11]。但NSBP1在体内的作用还不清楚。本实验用重组慢病毒NSBP1-RNAi-lentivirus和阴性对照慢病毒转染DU145细胞，再用转染细胞种植裸鼠皮下成瘤，实验结果证实移植瘤组织中NSBP1的mRNA减少72.2%，蛋白减少了75.1%。肿瘤生长曲线表明抑制组肿瘤体积明显小于对照组，抑瘤率约为40%，说明抑制 NSBP1蛋白的表达，对肿瘤细胞在裸鼠体内成瘤性没有影响，但对肿瘤的生长有明显抑制作用。
我们通过应用实时RT-PCR和Western blot分子生物学方法初步对NSBP1调控DU145肿瘤细胞生长的机制进行了探讨。细胞增殖与细胞凋亡是维持机体自身稳定的两个重要影响因素，二者之间平衡的打破是肿瘤发生和演进的重要原因。本课题组前期应用流式细胞技术检测细胞周期的改变，发现抑制NSBP1的蛋白表达后，LNCaP和PC3细胞在G2期被阻滞，结果提示NSBP1具有调控细胞有丝分裂的功能。国外也有研究证实HMGN蛋白与染色质的相互作用是细胞有丝分裂必要的条件[12]，发现HMGN1－/－鼠的成纤维细胞中G2/M期校验点活性的改变[13]。cyclinB1作为G2/M期的调控因子，在G2晚期，cyclinB1转录的增加是细胞有丝分裂进行的必须条件[14]。因此，cyclinB1的蛋白减少或许会减弱cyclinB1-CDC2复合体激酶的活性，继而导致G2/M期的阻止。我们对裸鼠肿瘤组织中的cyclinB1表达进行了检测，发现随着 NSBP1的蛋白表达降低，cyclinB1的mRNA减少了29.1%，蛋白表达减少了26.8%。实验证明降低NSBP1的表达，会影响cyclinB1基因的转录，导致肿瘤组织中cyclinB1蛋白表达的降低。凋亡也是参与细胞生长重要的生理现象，Bcl-2是抑制细胞凋亡的原癌基因[15]，我们也检测了肿瘤组织中Bcl-2的表达，发现Bcl-2的mRNA和蛋白分别降低了56.8%和45.3%。说明NSBP1在凋亡的调控过程中或许起了积极的作用。
我们的实验结果提示在前列腺癌DU145细胞中NSBP1与cyclinB1、Bcl-2之间可能具有相关性，NSBP1可能通过调控cyclinB1、Bcl-2的变化来调控细胞周期和凋亡的过程，继而影响肿瘤细胞的生长。但是这种相互作用关系是直接还是间接的，以及其所涉及的具体功能区域还需进一步实验证实。
（本文图1～2见PDF）
参考文献
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(编辑：郝锐 收稿日期：2009-10-12)