人白细胞抗原G（HLA-G）是一种非经典的Ⅰ类组织相容性复合体（MHC）分子，在体内存在膜型和可溶型两种形式。大量的研究结果证实，HLA-G可在免疫调节和免疫耐受中发挥重要的生物学作用[1]。有研究表明，HLA-G第8外显子3′非翻译区的14 bp 插入/缺失（ins/del）多态性可通过影响可溶性HLA-G（sHLA-G）分子的表达而与系统性红斑狼疮（SLE）发病相关[2]。本研究通过检测中国汉族SLE患者中HLA-G 14 bp ins/del多态性基因分布及血浆sHLA-G水平，旨在探讨此多态性位点对我国汉族人群中SLE发病和sHLA-G表达的影响。
对象与方法
一、研究对象
收集2007年12月至2009年2月来自川北医学院附属医院（107例）、遂宁市人民医院（31例）、新疆维吾尔自治区人民医院（93例）住院确诊的汉族SLE患者共231例，其中男15例，女216例，平均年龄（34.3±12.6）岁（14～79岁），中位病程36个月。所有患者均符合美国风湿病学会1997年修订的SLE分类标准[3]，详细记录患者的临床资料，包括症状、体征、实验室检查及药物治疗情况，SLE疾病活动性指数（SLEDAI）按照文献[4]标准进行评分。同时收集367例（川北医学院附属医院164例、遂宁市人民医院52例、新疆维吾尔自治区人民医院151例）年龄、性别匹配的健康体检者作为对照。
二、研究方法
1. 外周血基因组DNA提取：所有患者及对照人群均采集外周EDTA抗凝血2 ml。取混匀全血750 μl按照外周血基因组DNA提取试剂盒说明书提取基因组DNA，试剂盒购自北京天根生化公司（TIANampDNA Blood Kit，目录号DP 318-03）。提取DNA样本分装后置－20 ℃保存备用。
2. 聚合酶链式反应（PCR）：PCR引物由北京博迈德生物有限公司合成，序列如下：正向引物5′-GTGATGGGCTGTTTAAAGTGTCACC-3′，反向引物5′-GGAAGGAATGCAGTTCAGCATGA-3′；PCR反应条件：变性94 ℃ 2 min；循环反应：94 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,30个循环；延伸反应：72 ℃ 5 min。PCR反应试剂购自宝生物工程（大连）有限公司（TaKaRa DR001）。PCR反应完成后取5 μl产物进行3%琼脂糖凝胶电泳（含0.5 mg/ml溴乙啶），凝胶成像仪下观察并直接计数14 bp ins/del多态性基因型。因PCR产物为210 bp和（或）224 bp，直接根据PCR产物片段大小判断检测者基因型。
3. 血浆sHLA-G检测： 分别抽取96例SLE患者及74例健康体检者空腹肝素抗凝静脉血2 ml， 2 500 r/min，离心半径18 cm，离心10 min，采集血浆于－30 ℃保存备用。血浆sHLA-G的检测采用酶联免疫吸附法（ELISA），试剂盒购自武汉中美科技有限公司（产品编号：E1856h），操作按试剂盒说明书中的步骤进行。
4. 其他实验室指标检测：抗核抗体（ANA）检测采用间接免疫荧光法；抗dsDNA抗体采用放射免疫沉淀法；可提取性核抗原（ENA）采用免疫印迹法，试剂盒购自德国ELIROIMMUN公司。
5. 统计学方法：Hardy-Weinberg平衡、组间基因型及等位基因比较均采用χ2检验，组间计量资料的比较采用t检验。采用SPSS 11.5软件包处理数据，P＜0.05为差异有统计学意义。
结 果
1. HLA-G 14 bp ins/del多态性与SLE发病的相关性：HLA-G基因14 bp ins/del多态性位点和基因型频率分布在取自3个不同地区的正常人组之间基本相同，在SLE患者之间也无统计学意义，因而将3个不同地区的正常人归总为正常对照组，SLE归为疾病组。HLA-G基因14 bp ins/del多态性位点和基因型频率在正常人（χ2＝0.095，P＝0.953）与SLE患者（χ2＝1.383，P＝0.501）中的分布均处于Hardy-Weinberg平衡。
HLA-G 14 bp ins/del多态性位点在正常人和SLE患者均以14 bp缺失位点（del）频率最高，分别占60.6%和61.7%（χ2＝0.134，P＝0.714）；而基因型在正常人组和SLE组则均以del/del纯合子和ins/del杂合子占多数。del/del纯合子频率在正常人为37.3%，在SLE患者为40.7%（χ2＝0.676，P＝0.411）；ins/del杂合子频率在正常人和SLE患者分别为46.6%和42.0%（P＝1.214，P＝0.270）（图1）。采用比值比（odds ratio，OR）计数HLA-G 14 bp ins/del多态性位点和基因型在SLE发病中的相对危险性，结果显示该多态性位点和基因型频率与SLE发病均无显著的相关性（图1，2）。
2. 正常对照组和SLE患者组血浆sHLA-G水平检测结果：血浆sHLA-G水平在正常对照组为（118.3±38.1）U/ml，在SLE患者为（230.2±192.2）U/ml，两者比较差异具有统计学意义（t＝5.07，P＝0.0001）。我们将正常人组血浆sHLA-G水平的均值+3SD（230.2 U/ml）作为正常上限，血浆sHLA-G水平升高者在58名正常人中无一例，在96例SLE患者中有33例（34.4%）。63例血浆sHLA-G水平正常和33例血浆sHLA-G水平增高SLE患者的临床和实验室资料对照结果见表1。血浆sHLA-G水平增高SLE患者神经系统受累发生率明显高于血浆sHLA-G水平正常的SLE患者（24.2% vs. 4.76%，P＝0.007）。同时，前者的SLEDAI积分显著高于后者（10.70±5.37 vs. 8.27±4.62，P＝0.027）。根据SLE患者SLEDAI积分，我们将SLE患者分为活动期组（SLEDAI≥4）及非活动期组（SLEDAI＜4）,96例患者中活动期SLE有80例，非活动期有16例，血浆sHLA-G水平在前者为（241.3±180.3）U/ml，高于后者的（157.4±107.4）U/ml，但由于非活动期患者例数较少，未能达到有统计学意义（P＝0.108）。但血浆sHLA-G水平增高者在80例活动期SLE患者中有31例（38.8%），在16例非活动期患者中有2例（12.5%，P＝0.044）。
表1 血浆sHLA-G水平增高和正常的SLE患者的临床和实验室对照结果
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sHLA-G水平
|
例数
|
年龄
（岁，
 ） |
病程
（月，
） |
皮疹
[例，（%）]
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光过敏
[例，（%）]
|
口腔溃疡
[例，（%）]
|
关节炎/关节痛
[例，（%）]
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|
正常
|
63
|
34.2±15.4
|
37.4±31.7
|
44（69.8）
|
13（20.6）
|
21（33.3）
|
48（76.2）
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增高
|
33
|
32.6±14.1
|
34.2±32.1
|
19（57.6）
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10（30.3）
|
8（24.2）
|
23（69.7）
|
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P值
|
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0.372
|
0.461
|
0.229
|
0.292
|
0.357
|
0.491
|
|
sHLA-G水平
|
浆膜炎
[例，（%）]
|
肾炎
[例，（%）]
|
血液系统受累
[例，（%）]
|
神经系统受累
[例，（%）]
|
补体C3降低
[例，（%）]
|
抗dsDNA阳性
[例，（%）]
|
ANA阳性
[例，（%）]
|
SLEDAI
（
） |
|
正常
|
15（23.8）
|
43（68.3）
|
38（60.3）
|
3（4.8）
|
44（69.8）
|
40（63.5）
|
63（100.0）
|
8.27±4.62
|
|
增高
|
11（33.3）
|
25（75.8）
|
22（66.7）
|
8（24.2）
|
20（60.6）
|
19（57.6）
|
33（100.0）
|
10.70±5.37
|
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P值
|
0.319
|
0.442
|
0.542
|
0.007
|
0.362
|
0.572
|
0.833
|
0.027
|
3. HLA-G基因14 bp多态性对sHLA-G表达的影响：在健康对照组中del/del基因型的个体血浆sHLA-G水平最高，为（129.6±42.2）U/ml，而ins/ins基因型的个体血浆sHLA-G水平最低，为（107.0±41.3）U/ml，但三种基因型间的水平差异无统计学意义（F＝2.245，P＝0.113）。在SLE患者组，不同基因型组间血浆sHLA-G水平亦差异无统计学意义（F＝0.395，P＝0.675）（图3）。
讨 论
HLA-G基因属于非经典HLA-Ⅰb类基因，位于HLA基因区6 p 21.3，由16个外显子和7个内含子位点组成，其转录产物经选择性剪切产生7种mRNA，编码出7种HLA-G分子，即HLA-G1～G7。HLA-G1～G4为膜结合型，其中HLA-G1为全长mRNA编码，HLA-G2缺乏α2功能区，HLA-G3缺乏α2和α3功能区，而HLA-G4则无α3功能区。HLA-G5～G7为可溶型，所有的HLA-G分子都包含有α1胞外结构域，这是它们发挥生物学作用的共同基础。在生理状况下，HLA-G主要表达于胚胎滋养层细胞、胸腺上皮细胞和眼角膜细胞[1]。但近期的研究发现，HLA-G在肿瘤、病毒感染、器官移植等多种病理状态也有高表达，并且位于HLA-G第8外显子3′非翻译区的14 bp ins/del多态性可通过影响mRNA的稳定性最终影响sHLA-G分子的表达水平[5]。
大量的研究结果证实，HLA-G具有极强的免疫调节作用，主要表现为免疫抑制作用：（1）通过与自然杀伤细胞（NK）表面的杀伤细胞Ig样受体（killer cell Ig-like receptor，KIR）直接作用，抑制NK细胞的溶细胞功能[6]；另外sHLA-G还有效地通过凋亡机制导致NK细胞死亡进而抑制NK细胞的溶细胞功能[7]。（2）抑制CD4＋T细胞增殖和诱导CD8＋T细胞凋亡[8]。另外，可溶性HLA-G还可直接与CD8＋T细胞结合，上调Fas配体（FasL）和Fas的分泌，诱导CD8＋T细胞凋亡，而在抑制肿瘤免疫反应中起主要作用[9]。（3）促使Th1反应向Th2漂移，Baricordi等[10]在近期的报道中指出，HLA-G可抑制Th1型细胞因子表达，促使Th2型细胞因子分泌增多，同时Th2分泌的细胞因子IL-10又可上调HLA-G的表达，从而导致免疫平衡由Th1向Th2漂移。
SLE是一种产生多种自身抗体、累及多系统和多器官的自身免疫性疾病。大样本的流行病学调查发现SLE的同胞患病率是一般人群的20倍，同卵双生子发病一致率为24%～65%，明显高于异卵双生子的发病一致率（2%～9%），提示遗传因素在SLE发病中有着重要作用[11]。对狼疮动物模型的研究发现，多种基因的相互作用可影响动物的疾病易感性和患病后的表现[12]。而Müller-Hilke等[13]在对人组织相容性抗原与自身免疫性疾病的关系进行文献复习时指出，每一种自身免疫性疾病均不可避免地与其相关。Rizzo等[2]对意大利人群中200例SLE患者HLA-G 14 bp ins/del多态性进行DNA分型分析，并与相应人群中451名健康人对照，结果发现，14 bp插入位点和ins/ins基因型频率在SLE患者中明显增高，二者与SLE的发病存在显著性的关联。但我们对231例汉族SLE患者进行HLA-G 14 bp多态性基因多态性检测未发现HLA-G 14 bp ins/del多态性位点和基因型频率分布与正常对照组差异有统计学意义。这与最近Veit等[14]在巴西人群SLE患者中观察到的结果一致，提示HLA-G 14 bp ins/del基因多态性与SLE发病易感性的关联可能与人种有关。
如前所述，HLA-G第8外显子3′非翻译区的14 bp ins/del多态性可影响sHLA-G分子的表达水平。Chen等[15]通过检测150例汉族正常人HLA-G 14 bp ins/del多态性及相应血浆sHLA-G水平发现14 bp多态性与血浆sHLA-G水平有明显统计学相关性，ins/ins基因型的个体血浆sHLA-G水平较另外两种基因组的个体明显降低，而ins/del和del/del基因型的个体间血浆sHLA-G水平无差异。我们对74名健康对照者的血浆sHLA-G水平进行分析发现，虽然三种基因型的血浆sHLA-G水平无统计学意义，但是有着del/del基因型的个体血浆sHLA-G水平最高，而ins/ins基因型的个体血浆sHLA-G水平最低。
近期的研究结果显示，HLA-G在多种炎性疾病和自身免疫性疾病中表达发生改变，在哮喘患者的支气管上皮、溃疡性结肠炎患者的肠黏膜、银屑病患者的病损皮肤组织以及炎性肌病患者的肌纤维组织中均观察到有HLA-G的表达，表明HLA-G参与了这类疾病的病理生理过程。目前有关HLA-G在SLE病变中的作用研究甚少，仅有两篇报道。Rizzo等[2]检测了60例意大利人和70例丹麦人SLE患者的sHLA-G水平，并与相应的52名和76名正常人对照，结果显示两个人群中SLE患者sHLA-G水平均明显低于相应的正常对照组。Rosado等[16]检测了HLA-G在60例西班牙SLE患者中的表达，结果发现，血清sHLA-G水平在SLE患者均明显高于正常对照组。我们对96例SLE患者血浆sHLA-G检测结果显示，SLE患者血浆sHLA-G水平明显高于正常对照组，并观察到血浆sHLA-G水平增高的患者中枢神经系统受累发生率明显增高，患者的病情活动程度显著加重。造成上述各组观察结果的不一致可能与各组选择的观察病例不同有关，在Rizzo等[2]选择的病例中多为病情活动度相对较轻的患者（平均SLEDAI＝2），而我们和Rosado等[16]所检测的病例多为活动性病变患者。我们进一步对照活动期和非活动期SLE患者血浆sHLA-G水平表达情况也发现，38.8%的活动期SLE患者血浆sHLA-G水平增高，而有非活动期患者仅为12.5%，两者具有显著统计学意义。这提示HLA-G可能在SLE病理过程中发挥重要作用，Rosado等[16]在SLE的病变皮肤中观察到有HLA-G的高表达，进一步证实HLA-G分子参与SLE的病理过程。
(本文图1～3见PDF)
参考文献
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(编辑：巨娟梅 收稿日期：2009-10-30)