中华临床医师杂志（电子版） 2010年3月,4卷3期

论　著

经骨髓腔通路复苏失血性休克犬外周血中性粒细胞和血浆TNF-α及IL-4水平的变化

谢菲，王国建，宋青，江朝光

谢菲、宋青，北京 解放军总医院重症医学科，100853；王国建，耳鼻喉科；江朝光，医务部

摘要:目的　探讨经骨髓腔通路复苏失血性休克犬后外周血中性粒细胞（PMN）、血浆TNF-α和IL-4含量变化。方法　健康雄性犬随机分为三组：7.5%氯化钠羟乙基淀粉40溶液组（HSH组）、生理盐水组（NS组）、假手术组（Sham组）。建立犬失血性休克模型，分别从胫骨骨髓腔输注HSH、NS两种复苏液，观察复苏后PMN、血浆TNF-α和IL-4含量的变化。结果　失血性休克后，HSH组、NS组PMN数量均显著升高（P＜0.05）；复苏后各时点HSH组PMN数量持续升高，而NS组犬PMN数量呈降低趋势。休克后HSH组、NS组犬TNF-α、IL-4水平呈上升趋势；复苏后48 h，HSH组犬TNF-α与相应时点Sham组相比差异无统计学意义（P＞0.05）；HSH组犬IL-4于复苏后48 h显著高于相应时点NS组（P＜0.05）。结论　骨髓输注小剂量HSH（4 ml/kg）是一种安全、有效的复苏方案；HSH具有抑制炎症反应，促进致炎和抗炎性反应平衡的作用。

关键词:休克，出血性；　肿瘤坏死因子α；　白细胞介素4；　复苏术；　羟乙基淀粉；　动物实验

基金项目：解放军总医院十一五课题（08G122）

Mechanisms and production of plasma TNF-α and IL-4 in hemorrhagic shock canine resuscitated with intraosseous hypertonic saline solution

XIE Fei，WANG Guo-jian，SONG Qing，JIANG Chao-guang.

Department of Surgery Intensive Care Unit，General Hospital of PLA，Beijing 100853，China

Abstract:Objective　To investigate resuscitation effect and the production of polymorphonuclear neutrophils （PMN），TNF-α and IL-4 with intraosseous hypertonic saline in hemorrhagic shock canine. Methods　This study adopt Wiggers graded controlled hemorrhagic shock canine model，infusion low dose of 7.5% sodium chloride and 6% hydroxyethyl starch（HSH）and NS with tibia intraosseous access，monitor PMN density of peripheral blood during the phrase of hemorrhagic shock and resuscitation. The change of content of cytokines of TNF-α and IL-4 were measured with radioimmunity in hemorrhagic and resuscitation phrase. Results　During hemorrhagic shock stage，the density of PMN in experiment groups significantly decreased as compared with Sham group（P＜0.05）. In resuscitation phase，the density of PMN in HSH group continuous increased tendency as compared with Sham group（P＜0.05），however，downtrend occurred in NS group. During hemorrhagic shock stage，the content of TNF-α and IL-4 in experiment groups significantly increased as compared with Sham group（P＜0.05）and sustained high level during resuscitation phase. At time of 48 h resuscitation，the content of TNF-α in HSH group showed negative significant as compared with Sham group（P＞0.05），and the content of IL-4 in HSH group significantly higher than NS group（P＜0.05）. Conclusions　Intraosseous access techniques proved to be reliable means of alternative IV access. Low dose HSH resuscitation with intraosseous access is safety and effective fluid resuscitation concept. The infusion of HSH remarkably restricts inflammatory reaction，and modulates the balance of pro-and counter-inflammatory cytokine.

Keywords:Shock，hemorrhagic；　Tumor necrosis factor-alpha；　Interleukin-4；　Resuscitation；Hetastarch；　Animal experimentation

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　　严重创伤后常伴发失血性休克，这是危及伤病员生命的主要原因。但是在战创伤、地震等突发灾难性事件下，建立静脉输液通路非常困难，常导致伤员抢救延时。采用骨髓输液可以快速进行休克复苏。监测失血性休克动物的免疫/炎症反应在正确评价休克程度和治疗效果中起着非常重要的作用。
 
材料与方法
　　1. 器材与试剂：PGX-1000心电监护仪（日本电器公司），PB-7200呼吸机（美国Puritan Bennett公司），Gem Premier 3000血气分析仪（美国GEM公司），有创压力传感器（美国GE公司），医用低速离心机（白洋B600A型），SN-682型放射免疫γ计数器（上海核福光电仪器公司），DDL-5低温离心机（上海安亭科学仪器厂）。TNF-α和IL-4试剂盒（北京东亚免疫研究所、北京美迪科生物技术有限公司提供）。7.5%高渗氯化钠羟乙基淀粉复苏液（HSH）：66 g氯化钠加入6%羟乙基淀粉40溶液1 000 ml。
　　2. 实验动物及分组：健康雄性家犬18只（解放军总医院实验动物中心提供），体重16～19 kg。按 1～18编号并皮毛染色法作标记，应用随机数字法分为三组：7.5%氯化钠羟乙基淀粉40溶液组（HSH组）、生理盐水组（NS组）和假手术组（Sham组），每组各6只。
　　3. 失血性休克犬模型建立：采用改良Wiggers犬失血性休克模型[1]。给予气管插管、全身麻醉（3%戊巴比妥钠静脉麻醉30～40 mg/kg）、呼吸机辅助呼吸，行股动脉穿刺置管放血（血液回收入已肝素化的储血瓶内），使平均动脉压（MAP）降至60 mm Hg，维持90 min，再进行第二次放血，使MAP降至50 mm Hg，回输储血瓶中血液维持MAP稳定30 min，建立失血性休克模型。HSH组经骨髓腔快速推注HSH（4 ml/kg），5 min内完成；NS组推注生理盐水（4 ml/kg），5 min内完成；Sham组动物仅行全身麻醉、呼吸机辅助呼吸，不做放血和输液处理。观察2 h，待动物恢复自主呼吸后，拔除气管插管，送动物饲养室观察。
　　4. 外周血PMN测定：于休克终点、复苏后1 h、2 h测定PMN浓度。Sham组在上述时间点也进行相应的标本及血流动力学参数采集。
　　5. TNF-α和IL-4测定：分别于基础状态下、休克终点、复苏后2 h、48 h采静脉血5 ml，3 000 r/min离心3 min，离心半径10 cm，取上清分装于Eppendorf管中，－20 ℃保存，测定前将血清置冰水中复融混匀。按TNF-α和IL-4试剂盒操作手册测定，由自动γ计数器预先编制程序，直接给出有关参照、标准曲线及样品浓度。
　　6. 统计学处理：各组数据均用均数±标准差表示，用SPSS 11.0软件进行F检验和t检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。
 
结　　果
　　1. 生命体征变化：实验组犬失血性休克后，均出现口唇发绀，呼吸、心率明显加快，MAP降至60 mm Hg时，心率 140～180次/min，呼吸机辅助呼吸，呼吸频率20次/min，股动脉搏动明显减弱。MAP降至 50 mm Hg 时，心率 150～180次/min。
　　NS组2只犬于实验结束脱机时，出现呼吸急促，呼吸频率35～40次/min，考虑失血性休克后急性肺损伤（ALI），继续呼吸机辅助呼吸，静脉推注地塞米松 5 mg，同时复查血气示氧合指数210，观察10 min后安全脱机。其余实验组犬均安全脱机。Sham组6只犬围手术期无异常表现。
　　2. 外周血PMN变化：各组犬PMN基础值差异无统计学意义。休克终点时，HSH组、NS组PMN与Sham组比较均显著增加（P均＜0.05），HSH组与NS组差异无统计学意义（P＞0.05）。复苏后1 h、2 h时，HSH组PMN显著高于Sham组和NS组（P＜0.05），NS组与Sham组相比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。
 
表1　实验过程中三组犬外周血PMN变化（×109/L，）
组别
只数
基础值
休克终点
复苏后1 h
复苏后2 h
HSH组
6
10.57±2.01
14.21±1.06a
 15.15±1.27ab
 16.33±3.71ab
NS组
6
10.14±1.63
13.24±1.13a
12.85±1.28
10.35±1.24
Sham组
6
9.98±2.12
9.73±2.57
11.05±1.15
10.22±2.17
　　注：与Sham组相比，aP＜0.05；与NS组相比，bP＜0.05
 
　　3. 失血性休克犬骨髓输液复苏前后血清炎症因子的变化（表2）：休克终点HSH组、NS组TNF-α与Sham组相比较均显著升高（P均＜0.05）；复苏后2 h、48 h，NS组犬TNF-α显著高于Sham组和HSH组（P均＜0.05）；复苏后48 h，HSH组TNF-α与Sham组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。
　　休克终点、复苏后2 h、复苏后48 h，HSH组、NS组IL-4与Sham组相比显著升高（P均＜0.05）；复苏后2 h，HSH组IL-4水平显著低于相应时点NS组（P＜0.05）；复苏后48 h HSH组IL-4水平显著高于相应时点NS组（P＜0.05）。
 
表2　实验过程中三组犬血浆TNF-α和IL-4变化（ng/ml，）
检测指标
只数
TNF-α
基础值
休克终点
复苏后2 h
复苏后48 h
HSH组
6
0.492±0.051
1.433±0.219a
 0.985±0.073ab
0.568±0.075b
NS组
6
0.462±0.038
1.230±0.188a
1.343±0.238a
0.787±0.151a
Sham组
6
0.403±0.057
0.452±0.046
0.495±0.064
0.478±0.078
检测指标
IL-4
基础值
休克终点
复苏后2 h
复苏后48 h
HSH组
1.315±0.050
4.270±0.869a
3.098±0.283ab
 2.837±0.642ab
NS组
1.302±0.062
4.370±0.717a
4.040±0.168a
1.950±0.178a
Sham组
1.377±0.103
1.532±0.076
1.407±0.101
1.330±0.056
　　注：与Sham组相比，aP＜0.05；与NS组相比，bP＜0.05
 
讨　　论
　　失血性休克是创伤患者常见而严重的并发症，快速建立有效的输液途径进行复苏是抢救失血性休克的关键。与外周静脉不同，在休克状态下，髓腔内的静脉丛并不塌陷，输入骨髓腔内的液体迅速进入血液循环，骨髓输液已经成为急救复苏的新方法[2]。目前，通过骨髓输液复苏休克的液体种类繁多，晶体液可以维持心血管稳定性，但是输注大量晶体液后稀释了血浆蛋白，降低了胶体渗透压，增加了毛细血管通透性，加重了组织水肿。低分子羟乙基淀粉治疗低血容量性休克的效果等同于或优于明胶和白蛋白，是非常有效的血浆扩容剂，但对凝血系统可能存在着副作用。应用小剂量HSH（4 ml/kg）治疗是现代外科液体复苏的新概念[3]。HSH不仅能快速改善各种休克的血流动力学参数，提高心肌收缩力和心排出量，增强微血管的反应性，改善微循环，而且还能抑制创伤应激状态下的过度炎症反应。
　　在机体产生的各种细胞因子中，TNF-α起着关键性作用，是炎症反应中最早出现的炎症介质，被认为是细胞因子爆发的中心。TNF-α 可以加速PMN从骨髓释放，诱导内皮细胞分泌黏附分子，促使PMN趋化、聚集和黏附于血管内皮细胞并脱颗粒释放溶酶体酶，产生氧自由基和诱导产生急性反应蛋白等。在脓毒症的动物模型中，TNF-α与休克、多器官衰竭的发展直接相关。Rizoli等[4]通过临床研究同样证实了创伤和失血后TNF-α mRNA转录和血中含量迅速增加。Zingarelli等[5]研究表明，TNF-α对血管阻力和渗透性、低血压、心脏收缩力也有广泛的影响。knöfenl等[6]发现雌激素在稳定TNF-α介导的免疫反应中起重要作用，失血性休克后，雌激素抑制TNF-α的合成，可以降低脓毒症的死亡率，笔者提出女性性激素可能通过对TNF-α的调节作用防止创伤诱导的免疫抑制。本实验为了排除性别因素对实验结果的影响，均选用雄性犬作为实验研究对象，观察不同复苏液经骨髓腔通路复苏后细胞因子在休克不同发展阶段的变化特点。结果表明，犬失血性休克后血浆中炎症介质释放增多，HSH组在休克复苏后TNF-α呈降低趋势，而抑制炎症因子IL-4则处于高水平。这也许可以证明HSH在休克复苏过程中有调节促炎症因子和抑制炎症因子平衡的作用。
　　创伤和失血性休克后肺血管内净增的PMN是发展至ALI的先决条件。在离体实验中，分别将人PMN暴露于乳酸林格液与高渗盐中，乳酸林格液组PMN氧化爆发活性显著增强并呈现出剂量依赖性，而高渗盐组却未发现PMN激活增强。Gurfinkel等[7]研究发现，采用等渗溶液复苏的动物肺血管周围炎症和水肿比高渗盐复苏组严重，在炎症反应区主要以PMN浸润为主。本研究结果表明，休克复苏后HSH组循环血PMN数量较NS组显著升高，HSH可以抑制PMN聚集、附壁，减轻休克后组织的损伤；而NS组复苏后并不能抑制PMN向组织中的迁移，循环中PMN下降，大量PMN聚集在组织器官造成器官损伤。这也许可以解释本研究中NS组复苏后2只犬出现ALI的原因，而HSH复苏组无一只犬发生ALI。这间接表明高渗盐溶液可以降低失血性休克后发生ALI的几率。
　　综上所述，采用小剂量（4 ml/kg）的HSH经骨髓腔通路输液可以有效地进行失血性休克的复苏，骨髓输液是一种很好的静脉替代输液途径；小剂量的HSH可以抑制中性粒细胞附壁、游出，减轻组织损伤，有助于调节促炎症因子和抑制炎症因子平衡的作用，是一种有效的复苏手段。

参考文献

[1]　Wiggers HC，Ingraham RC. Hemorrhagic shock：definition and criteria for its diagnosis. J Clin Invest，1946，25（1）：30－36.[PubMed]
[2]　Moen TC，Sarwark JF. Compartment syndrome following intraosseous infusion. Orthopedics，2008，31（8）：815.[PubMed]
[3]　Bangerter C，Mines P，Sweet M. The use of intraosseous anesthesia among endodontists：results of a questionnaire. J Endod，2009，35（1）：15－18.[PubMed]
[4]　Rizoli SB，Kapus A，Fan J，et al. Immunomodulatory effects of hypertonic resuscitation on the development of lung inflammation following hemorrhagic shock. J Immunol，1998，161（11）：6288－6296.[PubMed]
[5]　Zingarelli B，Squadrito F，Altavilla D，et al. Role of tumor necrosis factor-alpha in acute hypovolemic hemorrhagic shock in rats. Am J Physiol，1994，266（42）：1512－1515.[PubMed]
[6]　Knöferl MW，Angele MK，Diodato MD，et al. Female sex hormones regulate macrophage function after trauma-hemorrhage and prevent increased death rate from subsequent sepsis. Ann Surg，2002，235（1）：105－112.[PubMed]
[7]　Gurfinkel V，Poggetti RS，Fontes B，et al. Hypertonic saline improves tissue oxygenation and reduces systemic and pulmonary inflammatory response caused by hemorrhagic shock. J Trauma，2003，54（6）：1137－1145.[PubMed]
(编辑：乔晓 收稿日期：2009-12-14)